健脾解毒方对多药耐药人结肠癌裸鼠异位移植瘤多药耐药相关基因蛋白mdr1及P-gp的影响*

万光升　刘丽丽　邓志红　许建华　李敬瑜　彭维真　李　萍　方　萍　梁　芳　张晓晓　孙　珏△

（1.上海中医药大学附属普陀医院，上海200062；2.广西壮族自治区桂林市中医医院，广西桂林541002）

·研究报告·

健脾解毒方对多药耐药人结肠癌裸鼠异位移植瘤多药耐药相关基因蛋白mdr1及P-gp的影响*

万光升1刘丽丽1邓志红2许建华1李敬瑜1彭维真1李萍1方萍1梁芳1张晓晓1孙珏1△

（1.上海中医药大学附属普陀医院，上海200062；2.广西壮族自治区桂林市中医医院，广西桂林541002）

目的观察健脾解毒方对裸鼠皮下移植瘤mdr1基因及P-gp的影响。方法采用HCT8/V细胞制作裸鼠皮下移植瘤，随机分为4组，生理盐水组（空白组）、长春新碱组（化疗组）、健脾解毒方组（中药组）、长春新碱联合健脾解毒方组（联合组），观察各组多药耐药相关基因蛋白的影响。结果健脾解毒方联合化疗组mdr1基因表达水平显著低于空白组，P-gp表达量下降。结论中药复方健脾解毒方能在一定程度上可联合化疗逆转多药耐药，与化疗药具有协同作用。

大肠癌多药耐药裸鼠健脾解毒方

大肠癌是临床上常见的恶性肿瘤，目前上海大肠癌发病率逐年升高，死亡率居高不下。尽管外科治疗是目前最根本的治疗方法，但相当一部分病患无法手术。对于手术切除者，姑息治疗是其中的治疗方法之一。术后绝大多数患者需要进行术后辅助化疗，而不能切除者，姑息化疗甚为重要。目前大肠癌的西药逆转剂有三苯氧胺［1］、自噬对苯丙素苷［2］、环孢霉素［3］等对大肠癌耐药细胞有一定的逆转作用，但均限于实验阶段。中医药在逆转大肠癌耐药方面具有广泛的前途，目前报道的有中药制剂有片仔癀［4］、姜黄素［5］、粉防己碱［6］等，但大部分均为中药单体的研究，复方研究较少。本课题组成员前期研究健脾解毒方［7］体外可有效减低耐药肿瘤细胞内Akt磷酸化，从而抑制PI3K/Akt信号通路活性，MDR1表达下降，从而增加长春新碱对大肠癌细胞的敏感性。课题组成员许建华博士［8］通过药物灌胃健脾解毒方干预，结果表明G1期细胞明显增加，S期细胞减少，细胞凋亡率明显增加，其作用可能与诱导细晌凋亡有关。在前期研究［9］的基础上，笔者发现中药复方可明显抑制裸鼠异位移植瘤的生长，且中药复方可联合长春新碱抑制肿瘤生长，减少肿瘤细胞的异形性，并出现部分细胞核固缩，且在一定程度上诱导肿瘤细胞凋亡。但其具体作用机制尚未明确，故本课题组成员继续从多药耐药方面研究其具体作用机制。现报告如下。

1　材料与方法

1.1动物与细胞SPF级BALB/c裸小鼠，平均每只体质量（20±5）g左右，雌雄各半，购于上海西普尔-必凯实验动物有限公司［许可证号为scxk（沪）：2012-0016］。人大肠癌多药耐药细胞株HCT-8/VCR，购于南京凯基生物科技发展有限公司，检测该细胞的多重耐药性，并对至少3种不同的化疗药物产生耐药性。

1.2试剂与仪器细胞培养液、血清、胰蛋白酶等试剂购于美国Gibco公司，细胞培养箱为英国RS Biotech公司生产。中药复方健脾解毒方，组成为：生黄芪、生白术、党参、猪苓、八月札、薏苡仁、野葡萄藤、红藤，含生药浓度为1.46 g/mL，由上海中医药大学附属普陀医院监制。人大肠癌多药耐药细胞株HCT-8/VCR所需的培养液为RPMI-1640培养液（含有青霉素100 U/mL、链霉素链霉素100 μg/mL、长春新碱浓度为2 μg/mL、10%胎牛血清的），生长环境为5%CO2培养箱，37℃培养。

1.3分组与造模1）动物模型的建立。选择生长良好、旺盛、无局部肿瘤坏死的裸鼠，脱颈椎处死，局部皮肤消毒，通常先用1%碘伏消毒，再用75%酒精消毒，小心仔细用眼科剪局部剪开包绕皮肤的肿瘤，沿移植瘤包膜小心剥离皮下肿瘤组织，将剥离的移植瘤块于无菌条件下，0.9%氯化钠注射液冲洗净表面的血污，去除坏死组织和纤维组织，通常组织类似鱼肉样。用眼科剪剪成约1 mm×1 mm×1 mm大小的组织块，在超净台用20 G套管针接种于裸小鼠背部右侧近前肢皮下，共接种40只裸鼠。3周后裸鼠多药耐药裸鼠异位移植瘤生长良好，模型建立成功。2）实验分组。选择瘤体直径0.5 cm左右、肿瘤生长良好、无自发性出血，无坏死、瘤周无感染病灶的荷瘤裸鼠共32只，作为实验动物，造模成功率为80%，并随机分组。共分为4组，空白组为生理盐水组，化疗组为长春新碱组，中药组为健脾解毒方组，联合组为健脾解毒方联合长春新碱组。3）细胞培养。HCT8/VCR细胞生长在上述浓度的培养液中，稳定传代。取处于对数生长期的细胞，常规胰蛋白酶消化制备单细胞悬液。用生理盐水重悬细胞，计数调整细胞浓度为1×107/mL。4）细胞的接种。接种方法参考《细胞培养》［10］，将上述悬浮的细胞快速接种于4～6周龄BALB/c裸鼠右侧腋下。接种之前常规酒精消毒，用1 mL微量注射器及23号针头吸取人大肠癌耐药细胞株HCT8/V单细胞悬液，确定针头位于裸鼠右侧近前肢皮下后，注入0.2 mL制备好的单细胞悬液，细胞数约为2×106个，共接种6只裸鼠。将接种后的裸鼠继续在SPF级隔离笼内生长，每日可见接种部位裸鼠逐渐长大，观察至18 d时，裸鼠皮下肿瘤生长至0.8～1.2 cm时。实验给药见表1。

表1　动物及给药情况

1.4观察指标荧光定量PCR法检测多药耐药基因mdr1，总RNA提取，进行鉴定，逆转录合成cDNA，扩增定量检测上述基因mRNA水平。以GAPDH为内参，采用TaKaRa公司SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒，ABI PRISM 7300Real-Time PCR（FQ-PCR）System对p53、Bax、Bcl-2进行扩增，定量检测上述基因mRNA水平。免疫印迹法检测P-gp的水平，组织的蛋白质抽提，蛋白质定量，SDS-PAGE电泳，制备分离胶（pH8.8），制备积层胶（pH6.8），样品准备，加入电泳缓冲液，上样，电泳，蛋白质转移，膜的封闭和抗体孵育，去除过量的溶液，将膜夹在两塑料薄膜之间，以X光胶片曝光，然后将图片自动扫描，以jpg格式保存于电脑，用ImageJ分析软件将灰度值具体数字化。

1.5统计学处理采用SPSS17.0统计软件分析。计量资料以（±s）表示，方差齐性检验后，采用单因素多样本均数比较。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1各组多药耐药基因mdr1的比较见表2，图1和图2。荧光定量PCR（FQ-PCR）结果显示，与空白组相比，化疗组mdr1基因表达水平显著上调，联合组mdr1基因表达水平显著下调（P＜0.05），而中药组无明显差异（P＞0.05），而与化疗组相比，中药组能下调mdr1基因表达（P＜0.05），联合组下调mdr1基因表达（P＜0.01）。

表2　各组治疗后mdr1 mRNA相对表达量比较（）

表2　各组治疗后mdr1 mRNA相对表达量比较（）

与空白组比较，*P＜0.05；与化疗组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。

分组n mdr1 mR NA（×10-3）空白组8化疗组8中药组8 1.03±0.18 2.13±0.76*1.20±0.21△联合组80.59±0.11△△

2.2各组多药耐药相关蛋白P-gp水平的比较见图3。Western Blot结果显示，四处理组对移植瘤细胞均有一定的影响，空白组、化疗组、中药组、联合组表达量分别为0.870、1.032、0.622、0.450，相对于空白组，化疗组多药耐药相关蛋白P-gp表达量略有升高，中药组P-gp表达下降，联合用药组P-gp表达量最低。临床症状、提高生活质量、延长患者生存期的作用，复方制剂既可治疗化疗引起的恶心呕吐，又可以扶正抗癌，通过增加患者白细胞、血小板等达到患者一定程度耐受化疗的目的。且本研究从体内、体外均充分验证了中药复方制剂可逆转大肠癌的耐药，其部分作用机制可能与下调mdr1、降低p-gp的表达密切相关。

图1　给药后各组mdr1 mRNA相对表达

图2　mdr1及GAPDH扩增曲线

由于逆转多药耐药的机制可能与肺耐药蛋白、膜运转蛋白、拓扑异构酶Ⅱ、谷胱甘肽转移酶、蛋白激酶等有关，故本实验从膜转运蛋白中的P-gp着手研究，探讨中药复方逆转多药耐药的部分作用机制。由于中药复方的多靶点性，其机制必然相当复杂，需要后续课题组成员进一步深入研究，明确中药复方制剂的作用机制。故摆在我们当前的任务是，寻找治疗中药复方逆转耐药的作用最强靶点，为中医药走向国际化铺平道路。

图3　处理后各组对HCT8/V裸鼠移植P-gp的表达图

3　讨论

大肠癌的首选治疗方式仍然为手术切除，但根治性切除的比率较低，术后转移及局部复发比率居高不下，达70%［11］，目前大肠癌的化疗方案有：FOLFIRI、FOLFOX4等，但临床上有效比率不高。其原因可能与大肠癌的化疗不敏感性有直接关系。而化疗的耐药是摆在临床医师面前的一个十分棘手的问题。中医学认为，大肠癌的发生发展主要是因为正气不足，湿毒、邪气等蕴结于肠道，日久形成肿块，进一步耗伤正气。而手术后患者脾气亏虚愈加明显，气损愈加严重，且化疗属于外毒范畴，更能加重脾气亏虚，癌毒聚集，导致气滞的发生。基于此，本课题从病机着手，拟健脾益气解毒法，创制健脾解毒方，方中生黄芪、生白术、党参、猪苓为君，扶助正气，八月札为臣助君行气，薏苡仁、野葡萄藤、红藤共为佐使，可化湿解毒，诸药合用共奏健脾理气解毒之功，符合临床病机。

中药复方制剂充分通过辨证施治，具有改善患者

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Effects of JianPi JieDu Decoction on Multidrug Resistance Associated Gene MDR1 and P-gp in Trans-planted Tumor of Nude Mice

WAN Guangsheng，LIU Lili，DENG Zhihong，et al.
Tumor department of TCM，Putuo Hospital Attached to Shanghai University of Chinese Medicine，Shanghai 200062，China

Objective：To investigate the effects of JianPi JieDu Decoction on transplantated tumor gene MDR1 and P-gp in nude mice.Methods：HCT8/V cells were subcutaneously injected into the flank of nude mice.Then mice were divided into four groups randomly：normal saline group（the control group），vincristine（VCR）group（chemotherapy group），Jianpi Jiedu Decoction group（Chinese medicine group），vincristine combined with Jianpi Jiedu Decoction group（the combined group）.The expressions of multidrug resistance associated proteins and genes in each group were monitored.Results：The expression of MDR1 in vincristine combine with Jianpi Jiedu Decoction group was significant lower than that of the control group.The expression of P-gp was downregulated. Conclusion：Tranditional Chinese Medicine compound（JianPi JieDu Decoction）combined with chemotherepy can reverse the resistanse of multidrug in a certain extent，which has a synergistic effect with chemotherepy.

Colorectal cancer；Multidrug resistance；Chinese compounds JianPi JieDu Decoction

R285.5

A

1004-745X（2015）12-2113-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.12.014

2015-07-20）

上海中医药大学预算内科研项目（2013JW63）

（电子邮箱：great-sunny@163.com）