刘豨汤抗大鼠肝纤维化作用机制的实验研究

2015-11-07刘新军王慧凯姜学连

中国中医急症 2015年12期

关键词：胶原西药纤维化

刘新军　王慧凯　姜学连△

（1.滨州医学院，山东滨州256603；2.滨州医学院附属医院，山东滨州256603）

·实验报告·

刘豨汤抗大鼠肝纤维化作用机制的实验研究

刘新军1王慧凯2姜学连2△

（1.滨州医学院，山东滨州256603；2.滨州医学院附属医院，山东滨州256603）

目的观察中药复方刘豨汤对肝纤维化血清学和免疫组织化学方面的作用。方法用猪血清腹腔注射法制作肝纤维化模型，通过运用刘豨汤做预防和治疗，研究记录治疗前后血清学肝功能、肝纤维化以及免疫组织化学指标，制作标本，最后用图像分析仪定量分析、统计及处理。结果刘豨汤治疗后，大鼠肝纤维化程度明显减轻，能够显著降低血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、门冬氨酸氨基转移酶（AST）、总胆红素（TBIL）、碱性磷酸酶（ALP）、肝纤维化指标Ⅲ型前胶原（PCⅢ）、Ⅳ型胶原（C-Ⅳ）、层粘连蛋白（LN）、透明质酸酶（HA）也受到抑制，并能抑制Ⅳ型胶原及LN合成、降低TGF-β1的表达。结论刘豨汤能够预防和治疗肝纤维化，证明其具有保护肝细胞、抑制胶原增生并促进降解、抑制TGF-β1的表达的作用。

肝纤维化作用机制实验研究免疫组织化学刘豨汤

刘豨汤具有活血化瘀、健脾、祛湿、解毒及消癥散结等作用，在临床上已证实能够较好地治疗肝炎及肝硬化早期患者，有效阻抑肝纤维化的发展进度［1］。目前该方主要用于临床治疗，未进行实验研究，目前尚不明确刘豨汤治疗肝纤维化的机制。故我们做了以下实验，以探讨其作用机制。现报告如下。

1　材料与方法

1.1动物98只Wistar大鼠，雄性，清洁级，大鼠体质量95～105 g，购于山东医科大学动物中心。

1.2试剂与药物中药复方刘豨汤：刘寄奴20 g，豨莶草30 g，柴胡6 g，郁金10 g，赤芍30 g，丹参20 g，茜草20 g，苍术10 g，土茯苓15 g，茵陈15 g，莪术10 g，泽泻10 g。中药购于广东一方制药有限公司，由专业人员煎煮、浓缩成含生药3 g/mL的药液；西药秋水仙碱，订购于广东彼迪药业有限公司，配制0.02 mg/mL浓度的灌胃药液。

1.3分组与造模将98只大鼠随机分为7组，每组14只，即正常对照组、模型1组、模型2组、中药预防组、中药治疗组、西药预防组、西药治疗组。建模与取材：参照于世瀛等［2］制作模型的方法，采集猪血清，注入大鼠腹腔，建造模型。正常对照组中，每只大鼠给予0.5 mL 0.9%氯化钠注射液腹腔注射。其余大鼠给药方式为：取猪血清0.5 mL，注入大鼠腹腔，每隔7 d给药2次，在第35日，取7只正常对照组大鼠，模型1组、两预防组所有大鼠，共49只，采用乙醚吸入的麻醉方式，分离大鼠股动脉，取血，分离血清，-80℃保存，留作检测血清学指标的标本；将以上大鼠处死后解剖，暴露肝脏，在距左叶边缘3mm处取肝脏组织，放入福尔马林液中固定肝组织，制作光镜标本及免疫组织化学标本，每次处死大鼠取材前，测量各组大鼠体质量并仔细记录。第70日，取7只正常对照组大鼠，模型2组、两治疗组所有大鼠，共49只，取血清及肝脏组织标本，方法参照第1次取材操作。给药方法，正常对照组及模型组按1.0 mL/100 g体质量给予0.9%氯化钠注射液灌胃，两预防组于给以药液灌胃，每日于下午5点灌胃1次，连续35 d，其中中药预防组按照3 g生药/100 g体质量的药物剂量灌胃给药，西药预防组按0.02 mg/ 100 g体质量的药物剂量灌胃给药，连续35 d。中药治疗组、西药治疗组于实验开始后的第36日开始给药，剂量、方式、时间同前。每7日测量1次大鼠的体质量，然后根据大鼠体质量的变化按时调整灌胃用药的剂量。

1.4观察指标1）血清肝功能指标应用生化分析仪检测，丙氨酸氨基转移酶（ALT），天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、血清总胆红素（TBIL）、碱性磷酸酶（ALP）、白蛋白（ALB）、白蛋白/球蛋白（A/G）；2）采取放免法检测肝纤维化指标、透明质酸酶（HA）、Ⅲ型前胶原蛋白（PCⅢ）、Ⅳ型胶原蛋白（C-Ⅳ）、层粘连蛋白（LN）；3）采用SABC法检测免疫组织化学指标：Ⅳ型胶原、层粘连蛋白（LN）、转化生长因子β1（TGF-β1）。4）光镜标本，取大鼠肝脏左叶距边缘3 mm处，大小约0.5 cm×0.5 cm× 0.5 cm的小块肝脏组织2～3块，取肝组织，10%福尔马林液固定，24 h后，依次进行脱水、包埋、切片、HE染色及Masson染色等实验操作，制作标本。采用图像分析仪检测、记录胶原含量。反应产物为棕褐色。

1.5统计学处理数据采用SPSS19.0数据分析软件，血清肝功能及肝纤维化指标各组间用χ2检验及t检验进行统计学处理，免疫组织化学结果采用图像分析仪测量，根据需要结果取均值，各组间采用t检验处理统计比较差异性。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1大鼠一般情况大鼠生长无异常变化，试验结束后，大鼠未出现死亡。制作模型及实验过程中，大鼠体质量的变化各组间无明显差别，大鼠外观正常，毛发无异常变化，大鼠可活动自如，食欲好，每周检测大鼠体质量增长无明显异常。各组大鼠性情平和，无攻击性，各组之间无明显异常。

2.2各组动物肝功能指标比较见表1。制作模型后，大鼠血清指标包括ALT、AST、TBIL、ALP均出现了大幅度的升高，ALB、A/G的水平则明显下降，说明正常对照组与模型组之间的差异有统计学意义（P＜0.01）；在经过药物的预防和治疗之后，预防及治疗组大鼠血清学肝功能指标出现了明显的恢复，结果证实，中药、西药治疗组之间的差异有统计学意义（P＜0.01）。

表1　各组大鼠血清肝功能指标比较（）

与正常对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与西药治疗组比较，#P＜0.05，##P＜0.01，下同。

组别n正常对照组14模型组28中药预防组14 ALB（g/L）A/G 36.5±2.81.12±0.04 27.26±1.6**0.68±0.21**36.7±1.2△△1.15±0.05△△中药治疗组14 43.25±6.37△△##174.34±21.43△△##7.±1.49△△##286.5±38.58△△##38.3±1.5△△##1.0±0.06△△##西药预防组14 78.84±10.49**△△194.38±32.26**△△9.87±1.72**△445.38±44.48**△△29.4±2.2**1.03±0.07△△西药治疗组14 81.54±12.30**213.42±32.16**10.42±1.69**526.34±41.68**28.6±2.1**0.84±0.11**ALT（IU/L）AST（IU/L）TBIL（mol/L）51.22±5.34136.57±46.326.54±1.40 96.31±14.62**241.11±51.16**10.46±3.25**43.37±7.18△△146.25±34.27△△7.81±3.02△△ALP（IU/L）246.87±56.79 597.36±84.30**256.38±21.65△△

表2　各组大鼠血清肝纤维化指标结果（）

组别n正常对照组14模型组28中药预防组14 HA（μg/mL）PCⅢ（μg/mL）C-Ⅳ（ng/mL）LN（ng/mL）105.47±13.4664.23±11.2576.38±18.27124.47±14.09 256.10±34.40**126.27±14.31**112.16±9.34**229.72±23.35**113.25±16.21△△78.28±10.56△△81.35±12.27△△132.78±32.03△△中药治疗组14136.32±23.41△△##86.32±12.53△△##89.24±15.25△△##143.42±21.53△△##西药预防组14124.35±11.39△△90.32±8.76△△89.38±1.72△△156.23±32.64△△西药治疗组14163.15±22.17△△98.38±14.35△△95.43±13.02△△176.31±42.37△△

2.3各组大鼠血清肝纤维化指标比较见表2。通过对比PCⅢ、C-Ⅳ、LN和HA含量，模型组血清中各指标含量明显增多，正常对照组中各指标水平则相对较低，证明两组之间的差异高度显著（P＜0.01）；相较于模型组，两治疗组及两预防组中各肝纤维化指标的水平均较低，肝纤维化指标的下降变化程度中，中药治疗组与西药物治疗之间的差异有统计学意义（P＜0.01）。

2.4各组大鼠IV型胶原、LN和TGFβ1表达比较见表3。1）Ⅳ型胶原：正常对照组中，Ⅳ型胶原于血管、胆管基膜内分布较多，其分布虽然比较连续，但形态则显得非常不规则，以沿血窦方向分布的胶原含量居多；模型组中，发现有Ⅳ型胶原阳性细胞，大处多在细胞外基质，Ⅳ型胶原大量分布，以纤维间隔内为主；两预防组中无大量的Ⅳ型胶原；西药预防组中，发现少量增生的Ⅳ型胶原，但尚未形成纤维间隔；西药治疗组中的Ⅳ胶原增生比较多见，还发现有纤维间隔，较模型组含量少。标本采用图像分析仪测量，通过比较两治疗组的结果发现，中、西药治疗组Ⅳ型胶原水平之间的差异有统计学意义（P＜0.01）。2）LN：在正常组中，中央静脉周围、汇管区血管和胆管周围发现有LN，多数分布于基膜，排布均匀，沿肝窦外方向分布；模型组中，发现大量增生的LN，主要位于基膜以及纤维间隔，在血管壁也有大量的LN；中药预防组和中药治疗组中，LN增生受到抑制程度最为明显，西药预防组及治疗组比中药组的增加量也很明显。标本采用图像分析仪测量，两治疗组比较后发现，中药与西药治疗组LN结果之间的差异高度显著（P＜0.01）。3）TGF-β1：正常对照组有TGF-β1表达，但TGF-β1的含量极少，模型组则发现了大量的TGF-β1阳性细胞，且分布范围具有集中于汇管区、肝血窦及纤维间隔周围的特点，经药物预防治疗后，TGF-β1阳性细胞含量明显减少，应用图像分析仪测量，比较结果发现模型组和西药治疗组比正常组具有更高含量的TGF-β1，较中药治疗组中的TGF-β1含量则显著增高，通过比较各组之间的结果发现，两治疗组之间的差异有统计学意义（P＜0.01）。

表3　各组大鼠免疫组织化学指标检查结果（）

组别n正常对照组14模型组28中药预防组14Ⅳ型胶原LNTGF-β131.25±5.4634.27±4.4912.38±2.23 263.10±34.43**316.49±38.37**142.76±21.69**35.58±6.21△△38.36±4.19△△13.74±5.49△△中药治疗组1436.42±6.48△△##73.28±23.25△△##17.21±6.48△△##西药预防组1464.49±10.17**△△190.36±35.39**△△35.431±0.27**△△西药治疗组14150.25±28.28**△△98.38±14.35**△△95.43±19.52**△△

3　讨论

肝纤维化是肝小叶的组织结构发生异常变化的过程［3］。在肝小叶受损初期，各种不同的损伤因素（包括化学及物理因素）发生后，肝星状细胞功能受到异常的影响，导致细胞外基质（ECM）持续不断的沉积在肝组织细胞周围，随着ECM大量异常的产生与沉积，肝小叶的功能与结构逐步发生了异常的变化，导致形成了肝纤维化［4］。本文通信作者姜学连教授从事在临床工作数十年，在辨证治疗肝纤维化方面，积累了丰富的临床经验，在应用刘豨汤治疗肝纤维化的过程中取得了明显效果。刘豨汤方中以刘寄奴、豨莶草为君药，其配伍之中兼具寒热同用、气血双治，既能发挥活血解毒、平肝、化瘀之功，又能起到散结、消癥、退黄利胆的功效。方中应用柴胡、郁金疏肝解郁，配以赤芍、丹参、莪术活血、养血，茜草化瘀止血，佐以茵陈清肝利胆、退黄，加泽泻以疏利三焦，土茯苓、苍术共同发挥健脾祛湿的功效，方中各种药物相互配伍，发挥活血化瘀、健脾、祛湿、解毒及消癥散结的功效。现代医学研究证明，刘寄奴［5］浓缩煎液可使大鼠血清谷丙转氨酶明显下降，有较好的利胆作用，豨签草［6］经水提取后，其成分具有抑制乙型肝炎病毒表面抗原增长的作用，柴胡［7-8］中含有大量的柴胡皂苷，研究表明其能够抑制肝星状细胞，同时还能促进细胞外基质的合成。另据研究发现，郁金［9］挥发油能增强机体免疫功能，尤其对于中毒性肝炎小鼠效果更明显。研究发现赤芍［10-12］具有抗炎细胞浸润、抗肝纤维化以及降低转氨酶和胆红素水平的作用。现代药理学发现茵陈［13-15］具有保护细胞膜、改善微循环、降酶等重要的作用。丹参［16］能够有效地降低转氨酶水平修复受损的肝组织，茜草［17-18］能够有效的抗炎、抗血小板聚集，苍术［19］则有保护肝细胞、抗炎的作用。土茯苓［20］则有预防肝癌的价值，泽泻［21］则具有较好的降脂作用，莪术［22］则具有抗凝和抑制血栓形成的作用。

本实验结果表明，刘豨汤能够明显降低血清ALT、AST、TBIL、ALP水平，并能显著升高ALB、A/G水平，同时能够有效抑制血清PCⅢ、C-Ⅳ、LN和HA的生成，并能明显抑制Ⅳ型胶原、LN、TGF-β1的表达。结果证实，刘豨汤具有抗肝纤维化的作用，其机制主要是阻抑肝细胞变性、坏死，减轻肝细胞遭到破坏的程度，加快促进合成糖原以保护细胞膜系统，并能阻抑TGF-β1的表达，从基因水平阻抑胶原及非胶原糖蛋白的合成过程，其抗肝纤维化效果明显优于秋水仙碱，为这一经验方的临床应用提供了科学的理论依据。

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