两性霉素B和伏立康唑对马尔尼菲青霉菌临床株超微形态影响的研究

张倩影 梁伶 曹存巍 刘栋华

·研究报道·

两性霉素B和伏立康唑对马尔尼菲青霉菌临床株超微形态影响的研究

张倩影 梁伶 曹存巍 刘栋华

目的 通过扫描电镜和透射电镜观察马尔尼菲青霉菌临床株经两性霉素B和伏立康唑作用前后超微形态的变化。方法 采用微量稀释法先测定两性霉素B和伏立康唑对马尼菲青霉菌临床株的最小抑菌浓度（MIC），在MIC和10倍MIC条件下，药物与菌作用24、48、72 h，分别在扫描电镜和透射电镜下观察马尔尼菲青霉菌的超微结构变化。结果 马尔尼菲青霉菌经两性霉素B作用后，随着药物作用时间延长及浓度增加，扫描电镜下可见到菌体破损，外层剥离、皱缩、断裂及粘连；透射电镜下线粒体变性，细胞核碎裂，细胞膜皱缩，胞质内细胞器消失，细胞壁断裂。经伏立康唑作用后，扫描电镜下可见到菌体破损、皱缩、干瘪、坍塌；透射电镜下均看到胞质内出现许多高密度的电子致密颗粒，线粒体变性，细胞壁表面粗糙，细胞膜皱缩、破损，胞质内各细胞器消失。结论 两性霉素B和伏立康唑对马尔尼菲青霉菌有明显抗菌作用，均可使其超微结构发生明显变化，与药物浓度及作用时间呈正相关。两种药物相比，两性霉素B对菌细胞损伤更明显。

显微镜检查，电子，扫描；显微镜检查，电子，透射；两性霉素B；伏立康唑；马尔尼菲青霉菌

马尔尼菲青霉病（Penicilliosis Marneffei）是由马尔尼菲青霉（Penicillium marneffei，PM）感染引起的系统性真菌病，是东南亚地区艾滋病患者最常见的机会性感染之一，误诊率极高［1］。及时、足量、有效的抗真菌治疗可使马尔尼菲青霉病长期缓解，两性霉素B仍是目前国内外推荐治疗的首选药［2］，但由于其严重的不良反应，限制了使用。伏立康唑是第二代三唑类广谱抗真菌药，具有广谱、抗菌效力强、安全的特点，但因价格昂贵，临床未能作为一线常规使用药物，对马尔尼菲青霉病的治疗经验缺乏。为了解两性霉素B和伏立康唑体外对PM形态学的影响，本实验采用微量稀释法测定两性霉素B和伏立康唑对PM临床株的最小抑菌浓度（MIC），并在扫描电镜和透射电镜下观察药物作用前后PM的超微结构变化，为临床用药提供一定的理论依据。

一、材料

1.受试菌株：来源于广西医科大学第一附属医院皮肤性病科真菌室收藏PM临床株1株，编号R9031。

2.抗真菌药物：两性霉素B标准粉末（寿光富康制药有限公司，批号：HAN0704302，纯度99.7%），伏立康唑标准粉末（寿光富康制药有限公司，批号：070724，纯度99.9%），均由北京大学真菌和真菌病研究中心赠送。

作者单位：530021南宁，广西医科大学第一附属医院皮肤科

3.培养基：RPMI 1640液体培养基。

二、方法

1.MIC测定：用RPMI 1640液体培养基将药物稀释，两性霉素B起始浓度32 mg/L，终末浓度0.0625 mg/L；伏立康唑起始浓度4 mg/L，终末浓度0.0078 mg/L，即2倍应测试药物。依次加入96孔板，每孔100 μl。采用CLSI推荐的M38-A方案将活化后的受试PM菌株用生理氯化钠溶液制成0.4×106～5×106CFU/ml菌悬液，再用RPMI1640液体培养基稀释50倍得2倍终浓度的菌悬液。96孔板中依次加入100 μl菌悬液，37℃培养72 h后用视觉法判定终点，两性霉素B和伏立康唑对PM临床株的MIC分别为0.25 mg/L、0.125 mg/L。

2.电镜观察：应用相应MIC及10倍MIC药物作用于对数生长期PM，放置37℃培养，分别于作用前及作用后24、48、72 h取标本用于电镜观察。

扫描电镜标本制备［2-4］：将培养液置于3%甲醛等量固定，4℃冰箱静置固定或过夜；将1滴培养液滴在粘有L-多聚赖氨酸的盖玻片上，干燥后磷酸盐缓冲液漂洗3次，每次10 min，4℃冰箱静置；乙醇系列脱水，乙酸异戊脂置换，二氧化碳临界点干燥，离子溅射仪喷金。

透射电镜标本制备［5-6］：将培养液置于3%甲醛溶液等量固定，4℃冰箱静置4 h或过夜。1 500 r/min，离心半径6 cm离心5 min，弃上清液，加入1~2滴琼脂液薄层封闭真菌，自然凝固，1%锇酸二次固定2～3 h；乙醇系列脱水，丙酮和包埋剂1∶1混合液浸透，室温静置，环氧树脂包埋，超薄切片及醋酸铀和枸橼酸铅双染色。

三、结果

1.扫描电镜观察结果：PM临床株培养24、48、72 h在扫描电镜下菌体表面光滑，分隔、分支（图1）。经0.25 mg/L两性霉素B作用后24 h：菌体皱缩，有轻度缺损和大小不等的凹陷；48 h：菌体外层明显剥离，干瘪；72 h：菌体明显干瘪、坍塌。经2.5 mg/L两性霉素B作用后24 h：多数菌体弥漫破损；48 h：菌体完全断裂、皱缩；72 h：菌体完全破损及碎片粘连。经0.125 mg/L伏立康唑作用后24 h：菌体局部出现小破损；48 h：菌体破损增大，部分干瘪、皱缩；72 h：菌体缺损，较多断裂。经1.25 mg/L伏立康唑作用后24 h：菌体部分破损凹陷，表面粗糙及皱缩；48 h：菌体表面不光滑，断裂；72 h：菌体干瘪、坍塌。见图1。

2.透射电镜观察结果：PM菌株见完整细胞壁、细胞膜，胞质内可见线粒体、微体、脂质体、内质网、细胞核等结构（图2）。经0.25 mg/L两性霉素B作用后24 h：细胞膜轻度皱缩，线粒体膜破损、嵴紊乱，细胞核部分溶解；48 h：细胞膜明显皱缩，细胞壁皱缩，细胞器结构不清晰；72 h：细胞膜、细胞器消失，胞质出现大片空白区，细胞壁断裂。经2.5 mg/L两性霉素B作用后24 h：细胞膜破损，可见大脂质体、线粒体残骸，余细胞器不清晰；48 h：细胞膜明显皱缩，胞质内细胞器不清晰，胞质浓缩呈颗粒状；72 h：细胞膜、细胞器溶解消失，细胞壁断裂，胞质内大片空白区。经0.125 mg/L伏立康唑作用后24 h：胞质内出现高密度电子致密颗粒，线粒体嵴融合消失；48 h：细胞膜明显皱缩、缺损，细胞核及线粒体等结构不清晰；72 h：胞质浓缩呈颗粒状，胞质内各细胞器消失，细胞膜降解，细胞壁轻度皱缩。1.25 mg/L伏立康唑作用后24 h：线粒体嵴不清，细胞核部分溶解，细胞壁粗糙；48 h：胞质浓缩、空泡，胞质内各细胞器结构不清；72 h：胞质明显空泡，细胞器消失，细胞膜溶解（图1）。

图1 马尔尼菲青霉菌经不同浓度两性霉素B、伏立康唑作用不同时间后的扫描电镜观察（×4 000） 未经药物作用的马尔尼菲青霉菌临床株菌体表面光滑，分隔、分支；随着两性霉素B作用时间延长及浓度增加，可见到菌体出现凹陷，外层壁剥离，菌体表面皱缩、弯曲，大小不一的破损，多处断裂及碎片粘连；经伏立康唑作用后，可见到菌体凹凸不平，部分干瘪、断裂，菌体表面粗糙、皱缩、凹陷，出现断裂、弯曲，粗细不一，缩窄处可见菌丝干瘪及坍塌

四、讨论

两性霉素B是多烯类抗真菌药，抗菌谱广，通过选择性地与真菌细胞膜的麦角固醇结合改变膜通透性，导致细胞内重要物质外渗而致真菌死亡。Brajatburg等［7］认为两性霉素B使细胞死亡并非单纯由于膜通透性增高所致，可能是由于膜通透性增高而使胞内离子紊乱及其他成分丢失等因素，导致细胞代谢紊乱；而细胞外自由基的进入加剧了细胞代谢紊乱，并可使细胞内结构破坏。伏立康唑属于第二代三唑类抗真菌药，具有广谱抗真菌活性。两性霉素B血药浓度约为2～4 mg/L，伏立康唑平均血药浓度为1 193～4 380 μg/L，本研究采用2种药物MIC和10倍MIC（两性霉素B和伏立康唑均处于血药浓度）作用于PM后，分别在扫描电镜和透射电镜下观察药物作用前后PM的超微结构变化。

图2 马尔尼菲青霉菌经不同浓度两性霉素B、伏立康唑作用不同时间后的透射电镜观察 正常马尔尼菲青霉菌株有完整的细胞壁、细胞膜，胞质内可见线粒体、微体、脂质体、细胞核；随着两性霉素B作用时间延长及浓度增加，可见到线粒体变性，细胞核碎裂，细胞膜皱缩，胞质内细胞器消失，细胞壁断裂；经伏立康唑作用后，均看到胞质内出现许多高密度电子致密颗粒，线粒体变性，细胞壁表面粗糙，细胞膜皱缩、破损，胞质内各细胞器消失

本实验中，扫描电镜下，未经药物作用的PM临床株菌体有分隔、短分支，表面光滑。低浓度和高浓度两性霉素B和伏立康唑作用后，PM临床株可见到菌体出现破损、皱缩，最后断裂。透射电镜下，PM临床株经MIC两性霉素B和伏立康唑作用24 h后，线粒体嵴紊乱不清，细胞核部分溶解。线粒体发生改变或消失，细胞呼吸链和整套酶系统受到抑制，氧化磷酸化和能量偶联系统遭到破坏，细胞能量减少，加上细胞核破坏消失，从而影响基因调控以及蛋白质、核酸的合成和DNA复制而导致细胞死亡。药物浓度增加及作用时间延长，两性霉素B作用后细胞壁断裂，细胞膜连续性被破坏，胞质内各细胞器模糊不清，内容物流出，作用至72 h细胞裂解。真菌细胞壁是真菌细胞最外层结构，在维持真菌形态及胞内高渗状态中起着极为重要的作用。PM临床株随着药物浓度增加及作用时间的延长，细胞壁、细胞膜、胞质内各细胞器损伤更明显，说明这两种药物对PM均具有较好及较稳定的杀伤作用。两性霉素B作用于PM后，除胞质内细胞器溶解、出现空泡等改变与伏立康唑的作用相似外，细胞壁也受到一定程度的破坏，胞质内容物流出，最后细胞凋亡，提示两性霉素B对PM的损伤可能更严重。

PM对于两性霉素B、伊曲康唑以及其他三唑类药物都敏感［8］。多数国家抗PM治疗均推荐首选两性霉素与伊曲康唑的治疗方案［9-11］。本实验菌株R9031分离于一艾滋病合并播散性马尔尼菲青霉病男性患者，该患者临床上首先用两性霉素B静脉滴注，首日5 mg，每日增加5 mg，至30 mg/d，疗程6周，病情控制后改为口服伊曲康唑400 mg/d巩固治疗3个月，完成治疗后改为口服伊曲康唑200 mg/d维持，观察1年内无复发。该菌株在扫描电镜和透射电镜观察，MIC浓度两性霉素B作用后72 h开始出现细胞凋亡，而浓度为10倍MIC时细胞损伤出现的时间更早且更明显，48 h细胞开始凋亡，72 h细胞完全崩解，故马尔尼菲青霉病应早期诊断，尽早应用有效、足量抗真菌药物。体外药敏试验结果显示，PM对伏立康唑有较高的敏感性［12］。国内外文献报道［13-14］，伏立康唑对马尔尼菲青霉病的治疗有较满意效果，而且患者容易耐受。本研究中应用MIC及10倍MIC的伏立康唑作用后，经扫描电镜和透射电镜观察，对PM临床株有明显抗菌作用，与体外药敏的高度敏感性呈正相关，提示该药对马尔尼菲青霉病的治疗也有较大的临床应用前景。对于因两性霉素B的毒副作用尤其是较严重的肝肾功能损害而不能耐受的马尔尼菲青霉病患者，伏立康唑可考虑作为代替的治疗药物之一。

［1］邓卓霖,马韵.马尔尼菲青霉穿通血管壁特性的研究［J］.临床与实验病理学杂志,1999,15（1）:30-31,插页6页.

［2］中华医学会感染病学分会艾滋病学组制订.艾滋病诊疗指南［J］.中华传染病杂志,2006,24（2）:133-144.

［3］岳学苹,王晓红,王爱平,等.伊曲康唑对皮肤癣菌形态学影响研究［J］.中国真菌学杂志,2009,4（5）:280-284.

［4］Nishiyama Y,Asagi Y,Hiratani T,et al.Ultrastructural changes induced by terbinafine,a new antifungal agent,inTrichophyton mentagrophytes［J］.Jpn J Med Mycol,1991,32:165-175.

［5］方芳,吕昭萍,王正文,等.山苍子油抗念珠菌的敏感性及作用机理的电镜研究［J］.中华皮肤科杂志,2002,35（5）:349-351.

［6］董小青,刘丽英,陈虹,等.土槿乙酸抗白色念珠菌的敏感性及作用机理的电镜研究［J］.天津药学,2008,20（2）:1-3.

［7］Brajtburg J,Powderly WG,Kobayashi GS,et al.Amphotericin B:delivery systems［J］.Antimicrob Agents Chemother,1990,34（3）:381-384.

［8］Sirisanthana T,Supparatpinyo K,Perriens J,et al.Amphotericin B and itraconazole for treatment of disseminatedPenicillium marneffei infection in human immunodeficiency virus-infected patients［J］.Clin Infect Dis,1998,26（5）:1107-1110.

［9］Ungpakorn R.Mycoses in Thailand:current concerns［J］.Nihon Ishinkin Gakkai Zasshi,2005,46（2）:81-86.

［10］Wu TC,Chan JW,Ng CK,et al.Clinical presentations and outcomes ofPenicillium marneffeiinfections:a series from 1994 to 2004［J］.Hong Kong Med J,2008,14（2）:103-109.

［11］Kaplan JE,Benson C,Holmes KK,et al.Guidelines for prevention and treatment of opportunistic infections in HIV-infected adults and adolescents:recommendations from CDC,the National Institutes of Health,and the HIV Medicine Association of the Infectious Diseases Society of America［J］.MMWR Recomm Rep,2009,58（RR-4）:1-207.

［12］Odabasi Z,Paetznick VL,Rodriguez JR,et al.In vitroactivity of anidulafungin against selected clinically important mold isolates［J］.Antimicrob Agents Chemother,2004,48（5）:1912-1915.

［13］Supparatpinyo K,Schlamm HT.Voriconazole as therapy for systemicPenicillium marneffeiinfections in AIDS patients［J］.Am J Trop Med Hyg,2007,77（2）:350-353.

［14］何浩岚,董永新,蔡卫平,等.伏立康唑与两性霉素B脂质体治疗艾滋病合并播散性马尔尼菲青霉菌病的对照研究［J］.热带医学杂志,2011,11（8）:924-926.

Effects of amphotericin B and voriconazole on ultrastructure of a clinical isolate ofPenicillium marneffei

Zhang Qianying,Liang Ling,Cao Cunwei,Liu Donghua.Department of Dermatology,First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University,Nanning 530021,China

ObjectiveTo observe ultrastructural changes in a clinical isolate ofPenicillium marneffei（PM）before and after treatment with amphotericin B or voriconazole by using scanning electron microscopy （SEM）and transmission electron microscopy（TEM）.MethodsA microdilution method was performed to determine the minimum inhibitory concentration（MIC）of amphotericin B and voriconazole against a clinical isolate of PM.Then,the PM isolate was treated with amphotericin B or voriconazole at their MICs and 10-fold MICs for 24,48 and 72 hours.The ultrastructural changes in this isolate before and after the treatment were observed by using SEM and TEM.ResultsAfter the treatment with amphotericin B,SEM showed that the conidia or yeast cells of the PM isolate were gradually damaged,and their outer layers experienced detachment,shrinkage,breakage and adhesion with the increase in treatment duration and concentrations of amphotericin B;TEM also showed degenerated mitochondria,broken nuclei and cell walls,and shrunken cytoplasmic membrane with disappearance of cytoplasmic organelles.Similarly,the damage,shrinkage,shriveling and collapse of PM cells were seen by using SEM,and TEM showed many high-density electron-dense granules in cytoplasm,degeneration of mitochondria,roughening of cell wall surface,damage and shrinkage of cytoplasmic membrane,and disappearance of cytoplasmic organelles after voriconazole treatment.ConclusionsAmphotericin B and voriconazole both had a strong antifungal effect on PM,and could induce evident ultrastructural changes,which were positively associated with treatment duration and concentrations.Moreover,amphotericin B caused more severe damage to PM compared with voriconazole.

Microscopy,electron,scanning;Microscopy,electron,transmission;Amphotericin B;Voriconazole;Penicillium marneffei

Liang Ling,Email:gxmull@163.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.08.013

国家自然科学基金（30560143）

梁伶，Email：gxmull@163.com

2014-08-01）

（本文编辑：颜艳）