桑叶多糖的分离纯化及其抗凝血活性的研究

张入飞，蔡为荣，谢亮亮，杨 蕾，陈 俏

桑叶多糖的分离纯化及其抗凝血活性的研究

张入飞，蔡为荣∗，谢亮亮，杨 蕾，陈 俏

（安徽工程大学生物与化学工程学院，安徽芜湖 241000）

为了研究桑叶多糖不同组分在体外的抗凝血活性，采用水提醇沉法提取桑叶粗多糖，聚酰胺进行脱色和脱蛋白.用DEAE sepharose CL-6B和sepharose CL-6B对桑叶多糖进行纯化，得到5种水溶性多糖组分（MPS-1、MPS-2a、MPS-2b、MPS-2c和MPS-3）.单糖检测结果表明：桑叶多糖主要是由半乳糖、葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖和甘露糖等组成.体外抗凝血活性检测显示5种桑叶多糖组分均能延长活化部分凝血活酶时间（activated partial thromboplastin time，APTT）和凝血酶时间（thrombin time，TT）、而对凝血酶原时间（prothrombin time，PT）影响不显著，说明它们是通过影响内源性途径或共同途径而发挥抗凝血作用；与对照相比，MPS-2b在试验浓度范围内对APTT和TT的效果达到极显著，表明MPS-2b有潜力开发成抗凝血活性物质.

桑叶多糖；分离；纯化；抗凝血活性

桑树是桑科桑属的落叶乔木，广泛分布于亚洲、欧洲、北美洲、南美洲和非洲［1］.它的叶子是蚕的食物，因而对养蚕业具有重要的商业价值［2］.传统的桑叶只用于养蚕，用途单一，易造成资源过剩现象.最近的研究表明，桑叶具有独特的药理作用，例如降血糖活性、抗氧化活性、降血压、抗衰老活性、增强机体免疫力以及抗癌功效［3-5］.多糖是桑叶中的主要化学成分之一，糖生物学研究成果表明，植物多糖具有降血糖、抗肿瘤、抗氧化等多种功效，因此，开发利用桑叶多糖具有理论价值和实际意义.彭延古［6］等发现桑叶提取物具有抗凝血活性，其抗凝作用主要是通过抑制凝血酶水解纤维蛋白原转变为纤维蛋白而实现的.包立军［7］等研究显示桑叶中的抗凝血活性主要集中在桑叶的水提液中，能够显著延长APTT值，虽然证明其抗凝血成分是一种多糖组分，但其并没有将桑叶多糖纯化和有针对性地进行抗凝血活性研究.到目前为止，国内外研究桑叶多糖的降血糖活性的报道较多，而对桑叶多糖的不同组分的抗凝血研究鲜有报道.

本研究是从桑叶中分离纯化出不同的桑叶多糖组分，测定它们的分子量和单糖组成，研究它们在体外的抗凝血活性，以期为桑叶多糖资源的开发利用和新型抗凝血物质的研究提供参考.

1　材料和方法

1.1材料与试剂

桑叶（安徽省亳州市蜀中中药饮片厂）；正常人体血浆（安徽省芜湖市中心血站）；聚酰胺80～100目（国药集团化学试剂有限公司）；DEAE sepharose CL-6B和sepharose CL-6B（Pharmacia公司）；葡聚糖标样、单糖标样和肝素（Sigma公司）；活化部分凝血活酶时间（APTT）、凝血酶时间（TT）和凝血酶原时间（PT）试剂盒（上海太阳生物科技有限公司）；浓硫酸、苯酚、无水乙醇等试剂，均为国产分析纯.

1.2仪器与设备

TH-1000梯度混合器、HL-1S恒流泵、BS-100A自动部份收集器、RE-52旋转蒸发仪（上海沪西分析仪器厂有限公司）；721分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）；真空冷冻干燥机（美国SIM公司）；IRPretige-21傅里叶变换红外光谱仪（日本岛津）；Waters 1525高效液相色谱仪（美国Waters公司）；MTN-Ⅱ血凝仪（长春市曼特诺医疗器械有限公司）.

1.3试验方法

（1）桑叶粗多糖的提取.桑叶经粉碎机粉碎过80目筛，贮存在干燥环境中.取100 g桑叶粉末，按料液比1∶20在70℃的恒温热水中浸提90 min，间歇搅拌.提取液经双层纱布过滤除去杂质，收集滤液，离心，旋转蒸发仪减压浓缩（60℃，50 r/min，真空度700 mm Hg），向浓缩液中加入无水乙醇使乙醇浓度达到80%，于4℃冰箱中醇沉24 h，在6 000 r/min下离心30 min.收集沉淀，真空冷冻干燥得桑叶粗多糖（CMPS）.

（2）桑叶粗多糖的分离纯化.脱色和脱蛋白：桑叶粗多糖（5 g）溶于蒸馏水，上聚酰胺吸附柱（600 mm× 26 mm），用蒸馏水以4 m L/min的流速洗脱.收集含糖洗脱液，用4倍体积无水乙醇醇沉，离心收集沉淀，真空冷冻干燥得到桑叶多糖（MPS）.

色谱柱纯化：桑叶多糖（150 mg）用蒸馏水溶解，离心除去不溶物，取上清液上DEAE sepharose CL-6B柱（600 mm×16 mm）进行分离.依次使用蒸馏水和0～2.0 mol/L的NaCl溶液进行梯度洗脱，自动部份收集器收集（3 m L/min，10 m L/管），用苯酚硫酸法［8］在490 nm下逐管检测多糖含量，按多糖含量检测值分别收集各单一峰组分，透析脱盐后，真空冷冻干燥.用高效凝胶过滤色谱法（HPGPC）［9］检测纯度，不纯的组分进一步使用sepharose CL-6B柱（500 mm×16 mm）进行纯化，用0.2 mol/L NaCl溶液洗脱，自动部份收集器收集（0.3 m L/min，3 m L/管），逐管检测多糖含量，收集单一峰组分，透析脱盐后，真空冷冻干燥.所有的单一峰组分通过HPGPC检测纯度和分子量.

（3）桑叶多糖的紫外、红外分析及单糖组成检测.桑叶多糖不同组分的溶液（100μg/m L）用紫外可见分光光度计在200～700 nm进行全波长扫描，检测桑叶多糖组分是否含有核酸和蛋白质.取少量多糖与KBr混合研磨压片，在4 000～400 cm-1范围内进行红外扫描，观察其红外光谱特征［10］.

取10 mg多糖样品加入2 m L 2 mol/L的三氟乙酸（TFA）溶液，抽真空封管，121℃水解1 h，减压蒸发去除TFA，后冷冻干燥的水解样品，将其溶于2 m L去离子水中，稀释50倍进样.单糖组成检测［11］条件：CarboPac TMPA1分析色谱柱（250 mm×4 mm）；流动相0.15 mol/L NaOH-0.15 mol/L Na Ac；脉冲安培检测器，金电极.

（4）桑叶多糖体外抗凝血活性检测.桑叶多糖的体外抗凝血活性检测APTT、PT和TT 3个指标.在测定中，新鲜静脉血与0.109 mol/L的柠檬酸三钠按体积比9∶1混合均匀，以3 600 r/min离心6 min，收集上层液体血浆，得到乏血小板血浆，在2 h内完成试验.多糖样品和血浆按1∶4的体积比混合，按照试剂盒和仪器的操作说明来测定以上3个指标的值，以肝素和生理盐水作为待测样品的阳性和阴性对照.

2　结果和讨论

2.1桑叶多糖的提取纯化

桑叶粗多糖在1.3（1）的提取条件下，粗多糖的得率为3.35%.桑叶粗多糖上聚酰胺柱后，脱蛋白和脱色率分别是87.7%和38.7%，多糖保留率达到88.3%，多糖损失的部分可能是由于聚酰胺的吸附造成的.与Sevag法和三氯乙酸法［10］相比，脱蛋白效果好且损失少，有利于多糖生物活性的保持，避免了大量有机溶剂的使用.

桑叶多糖经DEAE sepharose CL-6B柱分离出3种多糖组分，如图1a所示.3种多糖组分分别占总多糖的比例为30.9%、29.1%和40.0%，总的多糖回收率为67.5%.

经高效凝胶过滤色谱法检测后，MPS-2出现了3个峰（数据未展示），说明其为非均一组分；继续用sepharose CL-6B柱进行纯化，得到了3个多糖组分，如图1b所示.

5种桑叶多糖组分凝胶过滤色谱图及桑叶多糖的紫外可见全波长扫描光谱图如图2所示.MPS-2a、MPS-2b和MPS-2c占MPS-2的比例分别为13.4%、59.5%和27.1%，总的多糖回收率为71.4%.经纯化得到的5种多糖组分中，MPS-1是用蒸馏水洗脱出来的中性多糖；MPS-2a、MPS-2b、MPS-2c和MPS-3是用不同浓度的NaCl溶液洗脱出来的酸性多糖.所有的多糖组分都经高效凝胶过滤色谱检测，均观察到单一的对称峰，证明它们是分子量均一的多糖组分（见图2a）.根据分子量标准曲线，它们的重均分子量分别为2.45×106Da、2.45×105Da、7.99×104Da、1.97×104Da和3.22×106Da.桑叶多糖各组分在200～700 nm下进行紫外可见全波长扫描，结果显示5种桑叶多糖组分在260 nm和280 nm处没有显著地吸收峰，说明纯化后桑叶多糖组分不含核酸和蛋白质（见图2b）.

本次试验从桑叶中分离出5种桑叶多糖组分，分子量范围为1.97×104～3.22×106Da，且其纯度均在92%以上，有利于桑叶多糖生物活性的检测.应芝［12］等从桑叶中分离出两种桑叶多糖（MPS-1和MPS-2），分子量为24 898 Da和61 131 Da.本次试验得到的桑叶多糖组分没有与其分子量相似的组分，可能与桑叶多糖的原料和提取方法不一致有关.

2.2桑叶多糖的红外分析

桑叶多糖组分的红外光谱如图3所示.由图3可知，5种多糖在3 400 cm-1左右出现一宽峰，是O-H的伸缩振动峰，表明其存在分子内和分子间的氢键；2 928 cm-1左右是次甲基（-CH2-）中的C-H的伸缩振动吸收峰，1 609 cm-1左右的吸收峰是羧基离子的非对称伸缩振动峰；1 423 cm-1附近的吸收峰则是C-H的变角振动峰，由这两组峰可初步判断该化合物为糖类化合物.在1 200～850 cm-1范围内是“指纹区”［13］，1 000～1 200 cm-1间比较大的吸收峰是由两种C-O伸缩振动所引起的，其中一种是属于C-O-H的，另一种是糖环的C-O-C.1 100～1 010 cm-1的两个吸收峰表明桑叶多糖含有呋喃糖.

2.3单糖组成分析

单糖组成分析结果如表1所示.由表1可知，桑叶多糖MPS-1和MPS-2a组分相似，主要由半乳糖、葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖和甘露糖等组成.MPS-2b只含有4种单糖，半乳糖、葡萄糖、阿拉伯糖和鼠李糖的摩尔百分比接近5∶3∶2∶1.MPS-2c富含半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖、木糖和葡萄糖；相比之下，MPS-3还含有甘露糖.Hisato Katayama［14］等分离出的一种桑叶多糖（MP-3），该多糖由摩尔比为1∶0.2∶0.5∶2.3∶1.5的鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸构成.应芝［12］等得到两种桑叶多糖，MPS-1包含山梨糖、阿拉伯糖、木糖和葡萄糖；MPS-2是由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、半乳糖和岩藻糖构成.本次研究所得桑叶多糖的单糖组成与文献报道的有一定差异，可能与桑叶多糖的提取方法和分析方法不一致有关.

2.4体外抗凝血活性检测

桑叶多糖的抗凝血活性检测使用经典的APTT、PT和TT方法.APTT是用来检测内源性凝血途径中的Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅻ和激肽释放酶原.PT是检测外源性凝血途径.TT是纤维蛋白聚合过程的简单筛选试验，它是在血浆中加入一定量的凝血酶后，测量从纤维蛋白原转变为纤维蛋白的形成时间［15］.桑叶多糖抗凝血试验结果如表2所示.由表2可知，所有的多糖组分都能明显延长APTT，尤其是MPS-2b；在质量浓度为1 mg/m L时，与生理盐水相比，MPS-2b的凝血时间延长了27.1%.此外，MPS-2a、MPS-2b和MPS-3能极显著地延长TT，但是所有多糖组分对PT影响不显著.抗凝血试验结果表明，桑叶多糖是通过内源性或共同途径来影响凝血过程的［16］.

试验中得出在5种多糖组分中，MPS-2b在1 mg/m L的质量浓度下具有最高的抗凝血活性，研究MPS-2b在不同质量浓度（50～1 000μg/m L）下的抗凝血活性.研究结果表明，在试验浓度范围内，随着MPS-2b质量浓度的增加，APTT和TT的值随之增加，达到极显著效果，表明MPS-2b具有开发成抗凝血物质的潜力.

3　结论

桑叶多糖通过DEAE sepharose CL-6B和sepharose CL-6B柱纯化，得到5种水溶性多糖组分（MPS-1、MPS-2a、MPS-2b、MPS-2c和MPS-3），高效凝胶过滤色谱检测到单一的对称峰，表明5种桑叶多糖组分均为单一组分；5种桑叶多糖组分的重均分子量分别为2.45×106Da、2.45×105Da、7.99×104Da、1.97×104Da和3.22×106Da.红外光谱和全波长扫描结果说明它们是典型的多糖类物质，并且不含有核酸和蛋白质.单糖组成检测表明桑叶多糖主要由半乳糖、葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖和甘露糖等组成.体外抗凝血活性检测表明5种桑叶多糖组分均能延长APTT和TT，但对PT影响不显著，说明它们是通过影响内源性途径或共同途径而发挥抗凝血作用；MPS-2b在试验质量浓度范围内（1 mg/m L）对APTT和TT的效果达到极显著，表明MPS-2b有潜力开发成抗凝血活性物质.

［1］ J S Lee，A Synytsya，H B Kim.Purification，characterization and immunomodulating activity of a pectic polysaccharide isolated from Korean mulberry fruit Oddi（Morus alba L）［J］.Int Immunopharmacol，2013，17（3）：858-866.

［2］ M C L.Micropropagation of Morus latifolia Poilet using axillary buds from mature trees［J］.Scientia Horticulturae，2002，96：329-341.

［3］ J Sattayasai，S Tiamkao，P Puapairoj.Biphasic effects of Morus alba leaves green tea extract on mice in chronic forced swimming model［J］.Phytother Res，2008，22（4）：487-492.

［4］ 王小伙，郭金，王军文.桑茶的营养、药理初探［J］.蚕桑茶叶通讯，2000，101：32-34.

［5］ K Doi，T Kojima，M Makino，et al.Studies on the constituents of the leaves of Morus alba L［J］.Chem Pharm Bull（Tokyo），2001，49（2）：151-153.

［6］ 彭延古，葛金文，付灿云，等.桑叶提取液对凝血机制的影响［J］.湖南中医学院学报，2002，22（4）：21-23.

［7］ 包立军，张剑韵，黄龙全.桑叶中抗凝血活性成分的初步分离与纯化［J］.蚕业科学，2006，32（3）：418-421.

［8］ M Du Bois，K A Gilles，J K Hamilton，et al.Colorimetric Method for Determination of Sugars and Related Substances［J］.Analytical Chemistry，1956，28（3）：350-356.

［9］ X M Chen，J Jin，J Tang，et al.Extraction，purification，characterization and hypoglycemic activity of a polysaccharide isolated from the root of Ophiopogon japonicus［J］.Carbohydr Polym，2011，83（2）：749-754.

［10］江和源，陈小强，寇小红，等.茶多糖的分级纯化及组成分析［J］.茶叶科学，2007，27（3）：248-252.

［11］H Yokota，K Mori，H Yamaguchi，et al.Monosaccharide composition analysis of pamiteplase by anion exchange chromatography with pulsed amperometric detection［J］.J Pharm Biomed Anal，1999，21（4）：767-774.

［12］Z Ying，X Han，J Li.Ultrasound-assisted extraction of polysaccharides from mulberry leaves［J］.Food Chemistry，2011，127（3）：1 273-1 279.

［13］J Gao，T Zhang，Z Y Jin，et al.Structural characterisation，physicochemical properties and antioxidant activity of polysaccharide from Lilium lancifolium Thunb［J］.Food Chemistry，2015，169：430-438.

［14］H Katayama，R Takano，Y Sugimura.Localization of mucilaginous polysaccharides in mulberry leaves［J］.Protoplasma，2008，233（1-2）：157-163.

［15］P Ekanayake，C Nikapitiya，M Zoysa，et al.Novel anticoagulant compound from fermented red alga Pachymeniopsis elliptica［J］.European Food Research and Technology，2008，227（3）：897-903.

［16］张虹，蔡为荣，汤超群，等.低分子壳聚糖的磺化及其抗凝血活性初步研究［J］.安徽工程大学学报：自然科学版，2014，29（2）：38-41.

Isolation，purification and anticoagulant activity of the polysaccharide from the leaves of mulberry

ZHANG Ru-fei，CAI Wei-rong∗，XIE Liang-liang，YANG Lei，CHEN Qiao
（College of Biological and Chemical Engineering，Anhui Polytechnic University，Wuhu 241000，China）

To study different components of mulberry polysaccharides and their anticoagulant activity，the crude mulberry polysaccharides were extracted by water and precipitated by alcohol.The crude polysaccharides were decolorized and deproteinized by polyamide.Five water-soluble polysaccharides（MPS-1，MPS-2a，MPS-2b，MPS-2c and MPS-3）were purified by DEAE sepharose CL-6B chromatograph column and sepharose CL-6B chromatograph column.The monosaccharide compostion of MPS was composed mainly of galactose，glucose，rhamnose，arabinose，xylose and mannose and so on.APTT，PT and TT in vitro tests showed that they prolonged APTT and TT，but had no significant effect on PT.The result confirmed these in the regulation of coagulation initiated via the intrinsic pathway or common pathway；MPS-2b significantly prolonged APTT and TT compared to saline in experiment concentrations.These results suggest that the mulberry polysaccharide MPS-2b can be explored as a kind of natural potential anticoagulant.

mulberry polysaccharides；isolation；purification；anticoagulant activity

Q53

A

1672-2477（2015）02-0027-05

2014-12-31

国家自然科学基金资助项目（31171753）；安徽省自然科学基金资助项目（1408085MC52）；芜湖市科技局资助项目（2013119）；国家级大学生创新训练基金资助项目（201210363018）

张入飞（1989-），男，河北邢台人，硕士研究生.

蔡为荣（1963-），男，安徽芜湖人，教授，硕导.