桔梗总皂苷提取工艺优化*

李喜凤，安硕，张伟晓，王优湑，贾永艳

(河南中医学院药学院，郑州 450046)

桔梗为桔梗科植物桔梗[Platycodon grandiflorum(Jacq.)A.DC.]的干燥根[1]，是我国销量最大的 40 种传统中药材之一。《神农本草经》记载，桔梗性平，味苦、辛，具有化痰止咳、利咽开音、宣畅肺气、排脓消痈的功效[2]。桔梗的主要活性成分为桔梗皂苷[3]，具有抗低温、抗高温、抗毒、抗应激、抗放射、抗肥胖、抗肿瘤、抗水肿及利尿作用等，对增强细胞免疫和提高特异性抗体生成有一定作用，并对急性及慢性炎症也有较强的抗炎作用。为了更好的开发利用桔梗皂苷，笔者本实验采用正交实验设计[4-5]和星点设计－效应面法[6-8]，优化桔梗总皂苷的提取工艺，并比较两种实验设计方法的优缺点，为充分利用桔梗药材资源提供实验参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器 UV-2000型紫外分光光度仪(上海尤尼柯仪器有限公司)，YUEPINGFA2004b型电子分析天平(上海越平科学仪器有限公司，感量:0.01 mg)，KQ-100E型数控超声清洗器(巩义市英峪予华仪器厂)，电热恒温水浴锅(上海跃进医疗器械厂)。

1.2 试药 桔梗饮片(湖北金贵中药饮片有限公司，批号:131101);桔梗皂苷D(成都曼斯特生物科技有限公司，经高效液相色谱法测定，含量＞99.6%，批号:MUST-12082211);香草醛(天津市科密欧化学试剂有限公司，批号:20120911);其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 桔梗总皂苷含量测定

2.1.1 供试品溶液制备 取桔梗药材15 g，按各实验设计条件进行提取，合并提取液定容至250mL量瓶中。精密吸取5mL(相当于药材量0.3 g)，水浴挥干，纯化水溶解挥干所得物至20mL试管中，用水饱和的正丁醇萃取(4×20mL)，合并萃取液，回收正丁醇至干，残渣用甲醇溶解转移至10mL量瓶中，定容，摇匀，即得。

2.1.2 对照品溶液的制备 精密称取桔梗皂苷D对照品3.87 mg，置于10mL量瓶中，加甲醇溶解，并稀释至刻度，摇匀，备用。

2.1.3 最大吸收波长的确定 精密移取对照品溶液0.4mL及供试品溶液0.2mL，于70℃水浴蒸发至干，加入 5%香草醛-冰醋酸 0.2mL，高氯酸 0.8mL，于60℃水浴保温显色15 min，冰水浴中冷却5 min。加冰醋酸5mL，摇匀，立即在分光光度计波长400～800nm下扫描，同时空白溶液作参比。对照品及供试品的最大吸收波长均在478nm，故以478nm为测定波长。

2.1.4 线性关系考察 精密吸取对照品溶液 0.1，0.2，0.4，0.6，0.8mL，置具塞试管中，于70 ℃水浴挥干，按测定方法同法处理，测定吸收值并回归。以吸光度(A)为纵坐标，对照品质量为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程 A=1.49X+0.037，R2=0.9990。结果表明桔梗皂苷D 在0.03854～0.30836 mg范围内线性关系良好。

2.1.5 精密度实验 用同一对照品溶液，依“2.1.3”项下方法显色测定吸光度，连续测定5次，结果RSD为0.24%，说明仪器的测试性能良好。

2.1.6 稳定性实验 精密吸取同一供试品溶液，分别于0，10，20，30，40，50，60 min 进行测定，吸光度的RSD=0.26%，结果表明供试品溶液在60 min内基本稳定。

2.1.7 重复性实验 按照供试品溶液制备项下方法平行6份制备，分别测定各样品吸光度RSD=1.17%。

2.1.8 加样回收率实验 精确吸取9份已知含量的桔梗供试品溶液各1mL，分别精密加入桔梗皂苷D对照品适量，依“2.1.1”项方法制备供试品溶液，按照“2.1.3”项方法显色后测定吸光度，计算回收率。结果见表1。平均加样回收率为 99.71%，RSD为 1.72%(n=9)。

2.2 浸膏得率测定方法 精密吸取样品液50mL，置已干燥至恒质量的蒸发皿中，水浴挥干，105℃真空干燥，至恒质量后于干燥器中冷却30 min，迅速称定质量，计算，即得。

2.3 单因素实验

2.3.1 乙醇浓度考察 准确称取桔梗药材6份，每份15 g，分别加 10倍量 50%，60%，70%，80%，90%乙醇回流提取2 h，滤过，滤液减压浓缩，定容至100mL量瓶中，测定桔梗总皂苷的吸光度值，吸光度在乙醇浓度为70%时达到最大，当乙醇体积分数超过70%以后，吸光度值开始下降，所以选择乙醇浓度70%为最佳。结果见图1。

表1 桔梗皂苷D加样回收率实验结果Tab.1 Results of recovery test on kikyosaponin D

图1 不同乙醇浓度对桔梗提取工艺的影响Fig.1 Effects of different concentration of ethanol on the extraction process of Platycodon grandiflorum

2.3.2 溶剂倍量考察 准确称取桔梗药材5份，每份15 g，分别加 4，6，8，10，12 倍量 70%乙醇提取 2 h，滤过，滤液减压浓缩定溶至100mL量瓶中，测定桔梗总皂苷的吸光度值，结果见图2。

2.3.3 提取时间考察 准确称取桔梗药材6份，每份15 g，加 10 倍量 70%乙醇，分别于30，60，90，120，150，180 min提取1次，滤过，滤液减压浓缩，定容至100mL量瓶中，测定桔梗总皂苷的吸光度值，结果见图3。

图3 不同提取时间对桔梗提取工艺的影响Fig.3 Effects of different time of distillation on the extraction process of Platycodon grandiflorum

2.3.4 提取次数考察 准确称取桔梗药材15 g，加10倍量70%乙醇，提取3次，每次2 h，桔梗总皂苷第1次提取量占总量的绝大部分，前2次提取量占总提取量的比例为89.73%。故选择提取2次。

2.4 桔梗回流提取工艺优化

2.4.1 正交实验设计及结果分析 桔梗皂苷类成分可溶于水、甲醇，易溶于乙醇，本实验采用乙醇回流法进行提取，根据单因素结果，选用乙醇浓度、溶剂倍量、提取时间、提取次数4个因素，每个因素选3个水平，用L9(34)正交实验设计表安排实验，以桔梗总皂苷的含量为主和干膏得率为辅来评价指标。实验因素水平设计及实验结果见表2～5。

表2 L9(34)实验因素水平表Tab.2 Factors and levels of L9(34)experiment

结果分析如下。①直观分析:根据极差R的大小，所考察4个因素对桔梗总皂苷含量的影响，显著性大小为C＞D＞A＞B，即提取时间＞提取次数＞乙醇浓度＞溶剂用量。对干膏得率的影响，显著性大小为A＞D＞B＞C，即乙醇浓度＞提取次数＞溶剂用量＞提取时间。②方差分析:对实验数据进行方差分析。结果见表4和表5。分析结果表明，提取时间和提取次数对桔梗总皂苷收率有显著影响，乙醇浓度对干膏得率具有显著性影响。综合直观分析及工业生产中的实际情况，因此确定桔梗总皂苷的最佳提取工艺为6倍量70%的乙醇回流提取2次，每次180 min。

表3 L9(34)正交实验表和结果Tab.3 L9(34)orthogonal experiment table and results

表4 桔梗总皂苷含量方差分析Tab.4 Variance analysis of the content of total saponins from Platycodon grandiflorum

表5 干膏得率方差分析Tab.5 Variance analysis on the yield of dry extract

验证实验:在确定优化工艺后，进行3次验证实验。结果见表6。

由表6可以看出，该提取工艺稳定、可靠，达到提取优化的目的。

表6 验证实验结果Tab.6 Results of verification test

2.4.2 星点实验设计及结果 在单因素实验基础上，选取乙醇浓度(50%～90%)、溶剂倍量(6～12倍)、提取时间(30～200 min)为考察因素，由于提取次数为非连续变量，回归处理较困难，结合预实验结果和工业生产实际，将提取数定为2次。按星点设计-效应面法三因素五水平表进行实验，因素水平见表7，实验安排及结果见表8。

表7 因素水平表Tab.7 Factors and levels

以总皂苷含量和干膏得率为评价指标，每个指标均标准化的用Hassan分别转化为0～1的总评“归一值(OD)”，按 OD=(d1×d2…dn)1/n(n 为指标数)计算，对取值越小越好的响应和取值越大越好的响应进行数学转换求归一值 dmin和 dmax，dmin=(Ymax－Yi)/(Ymax－Ymin)，dmax=(Yi－Ymin)/(Ymax－Ymin)[8]。在本实验中，要求总皂苷的含量越高越好，干膏得率越小越好。

2.4.2.1 模型拟合 以各总评归一值对自变量进行多元线性回归和二项式拟合，运用统计分析软件Statistica10.0，拟合方程如下，多元线性回归方程:Y=－7.04524+0.0001X1+0.02559X2+0.9678X3，(r=0.7709)，F(3，6)=7.81。

二项式拟合方程为:Y=－79.88+1.3102X1+0.2057X2+5.1150X3－0.008－0.0006X1X2－0.0099X1X3－0.003X2X3(r=0.9799)。

从拟合方程的相关系数可见，多元线性回归方程的相关系数较低，表示自变量与因变量之间线性相关性较差，多元线性回归拟合度不佳，预测性较差，因此该数学模型不合适。多元二项式拟合方程相关系数较高，拟合效果较好。剔除不可信的b7、b8、b9进行重新拟合，得最终二项式数学模型:Y=－79.88+1.3102X1+0.2057X2+5.1150X3－0.008(r=0.9702)，简化后方程的r值降幅很小，说明此方程可信度较高。采用ANOVA分析效应面的回归参数。方差分析表见表9，结果表明提取时间和溶剂倍量二次项达极显著水平(P＜0.0001)，方程的拟合度和可信度均较好，与实际情况拟合度良好，可以对不同条件下提取结果进行优化和预测。

表8 星点实验设计与结果Tab.8 Central composite design and its results

2.4.2.2 效应面优化、预测 根据二次多项式模型，绘制各考察指标综合得分与各自变量间的三维效应曲面图。把因变量与另两因素拟合为三维曲面图，因只能表达含两个因素变量的函数，故固定3个变量中的一个为中值，再以拟合的目标函数为数学模型，绘制因变量曲面图和等高线(图4～6)，在图上选取较佳工艺范围X1:65%～75%，X2:10～12倍，X3:120～170 min，综合考虑工业生产中的实际情况，故选取提取桔梗中桔梗总皂苷的最佳工艺为:10倍量70%乙醇回流提取2次，每次140 min。

2.4.2.3 验证实验 根据最优工艺进行验证实验，实际总皂苷平均含量为33.86 mg·g－1(n=3)，实际值比预测值高1.02%。说明建立的数学模型可靠，预测性良好。

表9 回归模型的方差分析Tab.9 Variance analysis on the regression model

图4 乙醇浓度和提取时间对总评OD值的三维效应面图及二维等高线图Fig.4 3D predicted response surface and 2D contour line of ethanol concentration and distillation time versus total OD

图5 乙醇浓度和溶剂倍量对总评OD值的三维效应面图及二维等高线图Fig.5 3D predicted response surface and 2D contour line of ethanol concentration and solvent volume versus total OD

3 讨论

图6 提取时间和溶剂倍量对总评OD值的三维效应面图及二维等高线图Fig.6 3D predicted response surface and 2D contour line of distillation time and solvent volume versus total OD

目前桔梗的提取工艺优化多采用正交设计方法，本实验首次采用星点设计-效应面法对桔梗总皂苷进行提取工艺的考察，同时引入总评“归一值”对多指标进行处理，从实验结果可以看出，星点设计结合效应面优化法所得结果更加直观、便于分析，更适合于探索的实验研究，在最佳条件下效应的预测值和实测值偏差较小，且实验结果精确度较高，在实验设计中更有优势，而正交设计受所选线性模型的限制，只能指出某一因素的取值方向，无法求得极值，往往选择的条件均接近自变量的极大或极小值。综上所述，星点设计-效应面法更适合于桔梗总皂苷的提取工艺，此实验的研究为桔梗资源的进一步合理开发、利用奠定了基础。

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