口蹄疫O型液相阻断ELISA免疫抗体检测方法的应用

2015-11-05胡珊莲

浙江畜牧兽医 2015年1期

关键词：稀释液O型口蹄疫

胡珊莲

（上海市闸北区光明荷斯坦软业有限公司，上海闸北200436）

口蹄疫O型液相阻断ELISA免疫抗体检测方法的应用

胡珊莲

（上海市闸北区光明荷斯坦软业有限公司，上海闸北200436）

应用液相阻断ELISA试验方法检测上海光明荷斯坦牧业有限公司牧场牛群经口蹄疫O型灭活疫苗免疫的奶牛血清样品2412份。经检测，2412份样品中规模奶牛场牛群免疫抗体滴度≤1∶64样品42份，抗体滴度≥1∶128样品2370份，抗体保护率为98%。

液相阻断ELISA；O型口蹄疫；抗体检测；奶牛

口蹄疫属我国农业部公布的一类动物疫病，是由口蹄疫病毒引起偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性传染病，以牛，猪最易感，羊、骆驼、象等均有发病报告。该病可分为O、A、C、南非Ⅰ型、南非Ⅱ型、南Ⅲ型和亚洲Ⅰ型等7个血清型，其中以O型和A型分布最广，危害最大。

本试验应用液相阻断ELISA检测方法跟踪检测上海光明荷斯坦牧业有限公司下属牧场O型口蹄疫疫苗免疫抗体滴度水平，以利及时指导下属牧场O型口蹄疫防疫工作，为牧场健康发展提供有效保障。现将检测应用情况报告如下。

1 材料与方法

1.1 检测样品上海光明荷斯坦牧业有限公司下属牧场牛群经口蹄疫O型灭活疫苗（JYBL-2014-5-21）免疫的奶牛血清样品2412份。

1.2 实验器材酶标仪、37℃恒温温箱；5.0～50.0协L移液器、50.0～200.0协L移液器及50.0～300.0协L 12道移液器；配套移液枪尖，移液槽；吸水纸；96孔平底酶标板；96孔U形底聚丙烯微量抗原抗体反应板；检测试剂盒系采用中国农科院兰州兽医研究所口蹄疫O型抗体液相阻断ELISA检测试剂盒。

1.3 实验步骤

1.3.1 牛群免疫应用口蹄疫O型灭活疫苗按照产品说明书规定免疫剂量及免疫方法对公司下属牧场牛群接种免疫，于2免21 d后采血进行免疫效果检测。

1.3.2 试剂准备包被缓冲液（pH9.6）、磷酸盐-吐温缓冲液（PBST）、PBST稀释液、底物溶液按试剂盒说明书进行配制。

1.3.3 包被 pH9.6包被缓冲液稀释口蹄疫O型病毒兔抗血清至工作浓度（1∶1000），混合均匀，酶标板上每孔加入50协L，振荡，封板室温过夜，使抗体在pH9.6条件下吸附于酶标板上。

1.3.4 抗原抗体反应（对照血清及待检血清）以 96孔U型微量血凝板检测，以20份样品为例，需板2块，血清以倍比稀释法进行（注：空白孔为无样品加入）。

A.加PBST稀释。A1—A10加入150协L PBST稀释液，B1—B10，C1—C10，D1—D10，E1—E10各加入50协L PBST稀释液。H1加入150协L PBST稀释液，H2—H10各加入50协L PBST稀释液，A12—B12各加50协L PBST稀释液。

B.加血清稀释。在A1中加入50协L待检血清样品，混匀后取50协L加入B1，再混匀后取50协L加入C1连续2倍稀释（从A1 1∶4倍开始稀释到E1 1∶64倍，A1—A10共10个样品），直至加到E1混匀，再从E1中吸取50协L弃去。阳性血清取50协L加入H1，混匀后取50协L加入到H2，直至加入到H10混匀，再从H10中吸取50协L弃去（从H1 1∶4倍开始稀释到H10 1∶2048倍）。阴性血清取50协L加入A12，混匀后取50协L加入B12，混匀后取50协L弃去。

C.加病毒抗原。口蹄疫O型病毒抗原用PBST稀释液稀释到工作浓度（1∶12，即1份病毒抗原加11份PBST），96孔U型微量血凝板中待检样品血清及阴阳性血清每孔加50协L，加入等量工作浓度的病毒抗原后，血清稀释度加倍。E12—H12四个对照孔各加100协L稀释至工作浓度的病毒抗原。振荡，盖膜封板，2～8℃过夜（详见图1）。

图1 96孔U型微量血凝板10份血清加入工作浓度病毒抗原后的浓度表

1.3.5 洗酶标板及抗原抗体转移先将2块抗原抗体反应板从4℃中取出室温放置，用PBST稀释液连续洗酶标板4次，吸水纸上甩干，再将抗原抗体混合物从反应板上按次序转移至酶标板上的对应孔，每孔加50协L，封板，37℃温育60 min（详见图2）。

1.3.6 洗酶标板及加豚鼠抗血清用PBST稀释液连续洗酶标板4次，吸水纸上甩干，用豚鼠抗血清稀释液将口蹄疫O型病毒豚鼠抗血清稀释至工作浓度（1∶1000），每孔加50协L，封板，37℃温育60 min。

图2 96孔酶标板检测20份样品布局图

1.3.7 洗酶标板及加辣根过氧化物酶用PBST稀释液连续洗酶标板4次，吸水纸上甩干，用PBST稀释液将兔抗豚鼠IgG—辣根过氧化物酶结合物稀释至工作浓度（1∶500），每孔加50协L，封板，37℃温育60 min。

1.3.8 洗酶标板及加底物溶液用PBST稀释液连续洗酶标板4次，吸水纸上甩干，加50协L底物溶液（底物溶液每1 mL加10协L 3%双氧水），封板，37℃温育15min。

1.3.9 加终止液 15 min后，每孔加50协L终止液终止反应，在酶标仪上读取D492 nm值。

1.4 实验结果判定

1.4.1 实验认可标准每板设4孔病毒抗原对照，病毒抗原对照不加任何血清，直接用PBST稀释至使用浓度，与血清/病毒抗原复合物同步加入ELISA板孔，50.0协L/孔，病毒抗原对照D492 nm值应在1.5士0.5范围内。阳性对照抗体效价应在（1∶1024）士1滴度内，阴性对照血清抗体效价应＜1∶8。

病毒抗原对照平均D492 nm值50.00%计算（临界值），抗原对照4孔，弃去最高和最低D492 nm OD值，计算剩余2孔的平均D492 nm值，除2，即50.00%对照值。该值即为临界值，表示阻断50.00%反应的对照D492 nm值。

1.4.2 结果判定标准以病毒抗原对照平均D492 nm值的50.00%为临界值，被检血清稀释孔D492 nm值＞临界值的孔为阴性孔，≤临界值的孔为阳性孔，阳性孔的D492 nm值=临界值时所对应的稀释度为该份血清的抗体滴度。

2 结果与分析

2.1 病毒抗原对照D492 nm值 2412份检测血清样品，共采用121个ELISA板，484个病毒抗原对照D492 nm值在1.1～2.0范围内。

2.2 阴、阳性对照血清抗体效价 121个牛群检测血清样品ELISA板临界值均在对应板阳性对照血清1∶1024士1滴度的D492 nm值内，121个阴性对照血清样品1∶8处滴度的D492 nm值均≥相应板的临界值相。

2.3 O型口蹄疫牛群免疫抗体效果对上海光明荷斯坦牧业有限公司所属牛群2免21 d后进行口蹄疫O型灭活疫苗免疫抗体检测，采血检测2412份血样，ELISA抗体效价≥1∶128，2370份，判为O型口蹄疫抗体阳性，98%以上保护，ELISA抗体效价1∶64～1∶128则抗体滴度，取中间值为1∶90，判为可疑，50%以上保护。ELISA抗体效价≤1∶64，42份，判为O型口蹄疫抗体阴性，不保护。