在堆肥过程中添加外源菌剂对GH3真菌家族β-葡萄糖苷水解酶微生物群落的影响

林 敏，李洪涛，2* ，许修宏，李思琦

(东北农业大学资源环境学院，黑龙江哈尔滨150030)

堆肥是通过微生物对有机物的分解完成有机物无机化，同时微生物实现自身的增值［1］。我国北方以牛粪为原料的堆肥生产较为常见，但利用合适的外源微生物菌剂来提高堆肥质量尚是一个技术难点。在堆肥中的有机质中，木质纤维素属于难降解的部分。它的降解与否限制堆肥的腐熟。添加菌剂可以改变堆肥中各种微生物的数量和种类，使得木质纤维素降解加速，堆肥提早进入腐熟。许修宏等［2］利用牛粪和稻草共发酵的研究表明，添加外源微生物使堆肥中的纤维素酶、多酚氧化酶、过氧化氢酶均有所增加。

β-葡萄糖苷水解酶很广泛地存在于自然中。它可以来源于微生物、植物及动物，其中微生物来源较多［3-4］。不同微生物的β-葡萄糖苷水解酶按其分子结构特征分属为配糖水解酶家族1(GH1)和配糖水解酶家族3(GH3)两类［5］。同一家族中的β-葡聚糖苷酶基因同源性较高。

通过设计β-葡萄糖苷水解酶GH1和GH3家族的通用简并引物，采用PCR-DGGE技术，笔者探究了堆肥过程中不同时期相应功能性微生物群落的组成及其分布的变化，为进一步揭示与阐明添加外源菌剂对纤维素基质代谢的功能性微生物类群及其作用机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 堆肥材料与试验方法 采用自然通风堆肥的方式对牛粪、稻草秸秆进行好氧堆肥试验，堆肥初始C/N比为30，含水率为60%。试验地点在东北农业大学园艺站。设置堆体高1 m，直径约1 m，呈垛形。堆料分A、B组，其中A组为对照样，进行自然堆肥;B组添加菌剂DN-1(由许修宏老师实验室制，包括研究木质素降解的模式菌株——黄孢原毛平革菌，兼具木质素、纤维素、半纤维素3种酶活性的灰略红链霉菌C-5，从堆肥中分离得到的具有木质纤维素降解能力且能使堆肥快速升温的3株芽孢杆菌)。采用固态接种体，浓度为1×109CFU/g，接种量为10 g/kg，边建堆边添加菌剂，接种后均匀混合堆体材料。

1.2 β-葡萄糖苷水解酶活性的测定 利用固相酶活测定方法，检测堆肥样本的酶活。取堆肥样品，真空冷冻干燥处理后，-80℃保存备用。β-葡萄糖苷水解酶反应的底物为对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)，用对硝基苯酚溶液绘制标准曲线，线性反应监测时间为0、7、14、21 min，酶活反应温度50℃，测定400 nm波长吸光值。根据标准曲线法，求得测试液中相应的还原糖的量，计算酶活力［5］。

式中，c为15 ml测试液中转化的还原糖量，mg;V为定容体积，m;m为试样质量，g;V1为吸取酶液的体积，ml;t为水解时间，min。

1.3 采样与堆肥样品总DNA的提取 试验分别在堆肥发酵的第 0、1、3、6、9、12、15、18、19、22、24、28、31、46 天，分上、中、下层随机取样。分别在距堆体顶端30、60、80 cm处分五点采集样品，取得的样品混合均匀，采取四分法保留200 g，用保鲜袋密封，-20℃冷冻保存，以备分析、测定用。取10 g样品，加入灭菌的三角瓶中，加入10 ml灭菌的ddH2O于摇床中，转速为140 r/min，2 h;将摇匀的样品倒入10 ml离心管中，转速为1 000 r/min，离心5 min，取上清，重复一次此步骤;再倒入新的10 ml离心管中，10 000 r/min离心10 min，弃上清，收集菌体，沉淀作为样品。然后，取0.3～0.5 g沉淀样品。利用FastDNA SPIN Kit for Soil试剂盒提取样品总DNA，提取方法按试剂盒使用说明进行操作。

1.4 目的基因的扩增 GH3家族目的基因片段所用到的引物见表1。PCR采用50 μl反应体系:10×PCR缓冲液;5 μl脱氧核糖核苷酸(dNTP);引物(10 μmol/L)1 μl;1 μl DNA;1 UDNA聚合酶;4 μl浓度1%牛血清白蛋白(BSA);补足灭菌的 ddH2O 至 50 μl。

GH3家族真菌16S rDNA PCR扩增条件为:94℃5 min;94℃ 50 s，57.4℃ 1 min，72℃ 1 min，35个循环;72℃10 min;4℃ 59 min。

2 结果与分析

2.1 堆肥过程中温度的变化 温度是影响堆肥中微生物活性的最显著因子，是堆肥工艺的一个重要物理参数，也是影响酶活的主要因素。从图1可以看出堆体温度的总体变化趋势，主要是升温期、高温期、降温期和腐熟期4个过程。

表1 试验用到的引物

温度是影响微生物生长的重要因素。温度变化能很好地反映堆肥的进程。由图1可知，添加菌剂的堆肥在第3天进入高温期(＞60℃)，高温期持续20。自然堆肥虽然也在第3天进入高温期，但温度仅为45℃，且高温期仅持续14 d，高温期的平均温度低于菌剂堆肥。由此可见，加入菌剂可延长堆肥的高温期，提高堆体温度，促进堆肥腐熟。在堆肥腐熟后期，有机物的量大大减少，微生物在分解过程中无法产生足够的热量，使得温度呈连续下降趋势，直至堆肥结束。

2.2 β-葡萄糖苷水解酶酶活性的变化 由图2可知，在堆肥初期(0 d)，自然组堆肥和菌剂组堆肥β-葡萄糖苷水解酶活性别分别是0.54和0.48 U/L。在堆肥的前期也就是升温期(0～3 d)2种处理的β-葡萄糖苷水解酶活性均开始提高，期间自然组均高于菌剂组。在堆肥12 d，β-葡萄糖苷水解酶活性降到最低，随后急剧升高，菌剂组在堆肥18 d达到最高，而自然组在堆肥22 d达到最高，在此期间菌剂组β-葡萄糖苷水解酶活性均高于自然堆肥组。在堆肥20 d之后，堆肥进入降温腐熟期，2种处理的β-葡萄糖苷水解酶活性均开始降低，直到堆肥结束。在此期间自然组β-葡萄糖苷水解酶活性均略高于菌剂处理组。

2.3 PCR-DGGE分析相关微生物群落的组成及其演替 由图3可知，GH3家族真菌DGGE图谱微生物的多样性较高。在堆肥的升温期和高温前期(0～6 d)，自然组和菌剂组均没有检测到相应真菌。在自然堆肥过程中，堆肥达到高温阶段第8 天左右，A3、B3、C3、I3、E3、C3 等菌株开始陆续出现，此时微生物群落多样性达到最大值。在堆肥20 d之后进入降温期，A3菌消失，D3菌开始出现，一直持续到31 d堆肥结束。与自然堆肥相比，菌剂组的微生物多样性相对较少，真菌的种类也不及自然堆肥。在堆肥6～20 d整个高温期，只有H3、E3、F3、C34种真菌被检测到，随着堆肥化进程到达降温期(20～31 d)，除F3外的另外3种真菌均没有再出现。待堆肥结束进入腐熟期(31 d)，菌剂组堆肥能检测到的真菌只有J3、F3、D3。在整个堆肥进程中，自然组堆肥GH3家族真菌的多样性均高于菌剂组堆肥。

2.4 系统发育树分析 对β-葡萄糖苷水解酶基因GH3家族真菌群落的DGGE图谱进行分析。由图4可知，A3与Thermoascus aurantiacusst(JN121818)同源性高达92%，B3与Kluyveromyces marxianus(P07337)的同源性为70%，C3与Trichoderma reesei(KF979307)同源性为83%，D3与Aspergillus niger(Q9P8F4)同源性为83%，E3与Penicillium brasilianum(EF527403)相似性高达97%，F3与Aspergillus aculeatinus(KJ775261)同源性为 91%，G3则与Hypocrea lixii T7(EF426299)相似性达到86%。

A3菌属于嗜热子囊菌，出现在自然堆肥的高温期，温度降到40℃以下，检测不到该菌的存在。B3属于马克思克鲁维酵母，出现在自然堆肥12～20 d。酵母也是真菌中产β-葡萄糖苷水解酶的一个主要物种。C3为里氏木霉，属于好氧菌，是纤维素酶的主要生产菌，在堆肥的各个时期几乎都有出现。D3、F3均为曲霉属，出现在两种堆肥处理的中后期。E3为青霉菌，属于青霉属，出现在自然堆肥的降温期和菌剂堆肥的高温期，属于好氧的纤维素分解菌。G3为哈茨木霉属，只出现在自然堆肥的中后期。在堆肥过程中，GH3真菌家族分解纤维素的能力较强。优势菌种主要是木霉属和曲霉属。

3 结论与讨论

在堆肥0～6 d，温度快速升高，堆体温度上升到60℃(菌剂组75℃)。两种处理堆肥中β-葡萄糖苷水解酶活性都呈现略微上升的趋势。在此期间糖类蛋白质等大分子化合物被微生物分解利用，产生相应的能量，并且提高堆肥的温度。从微生物多样性来看，GH3家族真菌群落在两种处理堆肥中均没有被检测到，说明此时影响两种酶活性变化的主要是细菌。初步可以推断，GH3真菌家族在堆肥早期阶段发挥的作用并不明显。

在堆肥的高温前期(6～12 d)，两种处理堆肥的温度均稳定在60℃左右，微生物种类和数量变化较频繁，酶活性也出现相应的变化，其中菌剂组β-葡萄糖苷水解酶活性高于自然组堆肥。这表明菌剂处理组纤维素的分解速率要高于对照组。不同处理纤维素酶活性都呈下降的趋势，可以推断此期间纤维素的降解率并不高。两种不同处理堆肥的GH3真菌家族丰富程度不断提高，其中自然堆肥组微生物多样性要高于菌剂组堆肥。

当堆肥进入高温后期(12～20 d)，温度依旧维持在45℃(菌剂组50℃)以上。纤维素酶活性呈现急剧上升的趋势，并在18 d达到峰值，此期间纤维素类物质开始被大量分解。菌剂处理组纤维素酶活性远高于自然堆肥组，说明菌剂组堆肥在高温后期纤维素的降解速率高于自然组堆肥。从微生物群落多样性来看，GH3真菌物种丰富度不断增强，在12 d左右达到最高值，自然堆肥微生物多样性要高于菌剂组堆肥。真菌种数的增加以及同时期纤维素酶活性的提高，可以推断出真菌数量的增加是提高纤维素酶活性的主要原因。

在堆肥20 d之后进入降温期，温度开始下降，最后趋于环境温度。纤维素酶活性也不断下降，表明纤维素的分解速率开始逐渐变慢。此期间真菌种类有所下降。待堆肥化完成进入腐熟期(31 d)，温度接近于环境温度，纤维素酶活性的降低也有所减缓，微生物种类和数量也趋于稳定。这与Li等［6］研究结果相一致。

由此可知，接种菌剂堆肥进入高温阶段的速度比自然堆肥更快，并且最高温度也较高。在堆肥过程中，纤维素酶活性的变化呈“几”字型变化，高温期酶活性较高。在堆肥的升温期和高温期(0～20 d)，菌剂组堆肥β-葡萄糖苷水解酶活性均高于自然堆肥组。在堆肥各时期，菌剂组堆肥GH3细菌家族微生物多样性均低于自然堆肥组。堆肥的中后期真菌是主要的纤维素降解。优势菌种是GH3真菌家族的木霉属和黑曲霉属。

［1］陈晓飞，呼世斌，张婷敏.微生物菌剂对农业废弃物腐熟进程影响研究［J］.农机化研究，2012，4(4):198-202.

［2］刘佳，李婉，许修宏，等.接种纤维素降解菌对牛粪堆肥微生物群落的影响［J］.环境科学，2011，32(10):3073-3081.

［3］熊冬梅，周红丽.纤维素降解菌群的研究进展［J］.酿酒科技，2011(5):94-97.

［4］李洪涛，许修宏，卢新颖 等.好氧堆肥过程中β-glucosidase GH-1家族阳性微生物群落的相关研究［J］.东北农业大学学报，2011，42(9):119-124.

［5］耿玉清，王冬梅.土壤水解酶活性测定方法的研究进展［J］.中国生态农业学报，2012，20(4):387-394.

［6］LI H T，XU X H，CHEN H H，et al.Molecular analyses of the functional microbial community in composting by PCR-DGGE targeting the genes of the β-glucosidase［J］.Bioresource Technology，2013，134:51-58.