一株产碱性磷酸酶菌株的鉴定及酶的纯化

舒彦芳，马小花，杜诗熠，任 敏

(1.塔里木大学生命科学学院，新疆阿拉尔843300;2.新疆生产建设兵团塔里木盆地生物资源保护利用重点实验室，新疆阿拉尔843300)

碱性磷酸酶(Akaline phosphatases，AP，EC 3.1.3.1)是在碱性条件下将有机磷化合物释放为无机磷的一种低特异性的磷酸单脂酶。该酶在酶联免疫测定、生物传感器、杂交和测序、分子遗传学、农业生活中起非常重要的作用。从微生物到真核生物都可以找到该酶的踪迹，尤其是一些生活磷限制环境的微生物细胞，其碱性磷酸酶在碳、氮代谢中起非常重要的作用［1-2］。

从1960年开始，各种来源的碱性磷酸酶被陆续报道。大肠杆菌的碱性磷酸酶的结构、功能及催化特性是研究得最为清楚的。许多哺乳动物的碱性磷酸酶已被研究。研究者从深海的火山口附近分离出一种产碱性磷酸酶的古热球菌。该菌的碱性磷酸酶能耐100℃高温。自极端环境获得的微生物所产生的酶及基因产物由于能够在特定的苛刻条件下保持稳定并发挥较大的酶活，已引起研究者们极大的兴趣［3-5］。笔者就从实验室保存的极端嗜盐古菌进行碱性磷酸酶初步筛选，并对酶活高的菌株进行形态学、基因型等进行鉴定，为工业用酶的开发以及极端来源碱性磷酸酶嗜极机制的后续研究提供材料和科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种及培养基。极端嗜盐古菌tarim4为实验室分离自硝尔库勒盐湖(40°41＇N，76°53＇E)。培养基中含酸水解酪蛋白7.5 g/L，酶母提取物10 g/L，柠檬酸三钠3 g/L，MgSO4·7H2O 20 g/L，KCl 2 g/L，FeCl2·4H2O 0.036 9 g/L，NaCl 200 g/L，pH 7.2。蒸馏水900 ml，高温灭菌。标准菌株Natrinema pellirubrum CGMCC 1.3708T购自中国科学院微生物所。

1.1.2 主要试剂和设备。试剂有1×TE溶液、溶菌酶(50 mg/ml)、DNA聚合酶(广州东盛)、pMD18-T载体(大连TaKaRa)、DNA 回收纯化试剂盒(上海生工);IPTG、X-gal、浓度20%NaCl溶液、磷酸苯二钠、Q琼脂糖凝胶FF/Q Sep、Superdex 20050mM Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液，琼脂糖凝胶柱(10 mm ×300 mm)。

1.2 方法

1.2.1 形态学特征。细胞形态、运动性按照文献［6］进行。

1.2.2 生理生化生长条件及抗生素敏感。按照文献［6］检测以下指标:菌体细胞生长所需盐浓度范围及最适NaCl、MgCl2、pH、温度等;硝酸盐、精氨酸和二甲基亚砜的厌氧实验，硝酸盐、亚硝酸盐还原硝酸盐产气，H2S产气，碳氮利用及抗生素敏感。主要用的抗生素有红霉素、氯霉素、利福平、杆菌肽、青霉素、新霉素、氨苄青霉素、环丙沙星、新生霉素、氟哌酸、链霉素、万古霉素、卡那霉素、呋喃妥因、甲氧苄啶。

1.2.3 基本碳源和能源物质生长利用。按照文献［7］进行基本碳源和能源生长利用试验。所选择的42种碳、氮源为:葡萄糖、半乳糖、棉籽糖、甘露糖、果糖、L-山梨糖、D-木糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、淀粉、甘油、甘露醇、D-山梨醇、醋酸盐、丙酮酸盐、DL-乳酸盐、琥珀酸盐、延胡索酸盐、L-苹果酸盐、柠檬酸盐、L-结氨酸、甘氨酸 L-丙氨酸、L-苏氨酸、L-酪氨酸、L-精氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-赖氨酸、L-鸟氨酸、L-脯氨酸、L-天冬酰胺、L-蛋氨酸、L-色氨酸、L-半胱氨酸、L-胱氨酸、L-丝氨酸、L-亮氨酸、L-谷氨酸盐、L-苯丙氨酸、L-异亮氨酸。

1.2.4 16S rRNA基因序列分析。

1.2.4.1 16S rRNA基因的PCR扩增。按照文献［6］进行菌体总DNA的提取。古菌16S rRNA基因通用引物F1:5＇-TTCCGGTTGATCCTGCC-3＇ 和 R1:5＇-AAGGAGGTGATCCAGCC-3＇，扩增片段大小约1.5 kb。PCR反应体系:10×Taq缓冲液 2.5 μl，dNTP 混 合 物 (2.5 mmol/L)3 μl，F1(10 μmol/L)0.5 μl，R1(10 μmol/L)0.5 μl，Taq 酶(5 U/μl)0.3 μl，模板 DNA 0.5 μl，ddH2O 补至 25 μl。PCR 反应条件为:95 ℃ 5 min，95 ℃ 1 min，51 ℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min，30 个循环，72℃10 min。将PCR扩增产物用琼脂糖凝胶1%(W/V)电泳，染色后在凝胶成像系统观察并拍照(目的条带大小为1.5 kb)。

1.2.4.2 克隆测序。将目的大小的PCR产物回收、纯化后与pMD18-T载体相连，重组片段经过DH5α大肠杆菌克隆增殖后，用上述古菌通用引物菌落PCR验证，选取阳性克隆20个，送由上海生物工程有限公司测序。

1.2.4.3 16S rRNA基因分析。用DNAStar软件包中Seq-Man软件剪辑所得序列，剪辑后序列通过Eztaxon server 2.1分析其潜在的分类地位，并且采用MEGA5.0软件包中的Clustal W对下载相关序列多位序列比较，对比较后的序列采用N-J法构建系统发育树。

1.2.5 DNA的G+C mol%含量测定。G+C mol%含量测定采用热变性温度法(Tm值法)［7］。

1.3 酶活检测及酶纯化

1.3.1 碱性磷酸酶活性检测［8］。将新鲜菌悬液离心，用液氮和常温反复冻融，12 000 r/min，4℃ 离心10 min，取上清液500 μl加到1 000 μl含4-氨基安替比林(0.15%，W/V)的碳酸盐缓冲液(0.1 mol/L，pH 10)，37℃水浴5 min，再加入磷酸苯二钠(0.02 mol/L)1 000 μl，37℃水浴15 min后立刻加入3 μl铁氰化钾溶液，立即充分混匀后，将其在分光光度计510 nm波长处比色，用蒸馏水调零，以未接种的培养液为对照。酶活定义为37℃下每分钟产生1 μmol游离酚的酶量为一个酶活单位(U)。

1.3.2 微孔板法初筛碱性磷酸酶产生菌。将0.1 mol/L碳酸盐缓冲液(4-氨基安替比林，pH 10.0)50 μl点样于40孔微孔板中(对照孔加量为55 μl)，用无菌牙签取各菌种等量菌苔与上述缓冲液充分混匀，37℃水浴5 min放置后，将已预热的磷酸苯二钠溶液(0.02 mol/L)50 μl加入孔中，37℃反应15 min后加入铁氰化钾溶液150 μl，显色，并终止反应。以红色作为初筛产碱性磷酸磷酸酶的菌体。

1.3.3 酶的纯化及SDS-PAGE检测［9］。

1.3.3.1 制备粗酶液。新鲜菌液按1%接入2 L CM(浓度20%NaCl，pH 8.0)液体培养基中，放入 37℃ 摇床，200 r/min培养72 h左右。当OD600nm在1.0以上时，10 000×g离心10 min，4℃，收集菌体。菌体用50 mmol/L Tris-HCl(pH=8.0)重悬，超声裂解。10 000×g离心20 min，4℃ 离心，上清即为粗酶液体。粗酶液体-80℃ 保存。

1.3.3.2 (NH4)2SO4沉淀。将上述粗酶液体加入硫酸铵至80% 饱和度，4℃ 静置过夜。10 000×g离心15 min，将沉淀溶解Tris-HCl(50 mmol/L，pH 8.0)缓冲液，将酶液脱盐冷冻干燥后-40°保存。

1.3.3.3 初步纯化酶蛋白。将上述脱盐的酶液用平衡液(50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0)溶解，加到用50 mmol/L Tris-HCl、pH 8.0充分平衡后的Q琼脂糖凝胶FF柱，用0.1～2.0 mol/L NaCl(50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0)洗脱液洗脱，收集0.4 ～0.8 mol/L NaCl(50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0)，各个组分放于-80℃保存。

2 结果与分析

2.1 菌株形态学特征 细胞呈球形(图1)，大小2.73 μm，无鞭毛，能运动。革兰氏阴性菌，在牛奶盐平板上培养至7 d时菌落呈圆形，橘色，表面光滑湿润，有黏性，边缘较整齐，菌落直径为1～2 mm。

2.2 生理生化及生长条件、抗生素敏感试验

2.2.1 生理生化及生长条件。

2.2.1.1 温度对菌株生长的影响。tarim4在温度37～40℃时都能生长，但是37℃是最适的生长温度。

2.2.1.2 NaCl质量浓度对菌株生长的影响。tarim4在NaCl质量浓度为8% ～20% 的培养基中生长良好，最适生长为15%;NaCl浓度12% ～23%是tarim4和Natrinema pellirubrum CGMCC 1.3708T生长较适合的范围。

2.2.1.3 Mg2+质量浓度对菌株生长的影响。tarim4不需要Mg2+就能进行生长。相比较来说，Mg2+浓度0.005～0.3 mol/L是菌株Natrinema pellirubrum CGMCC 1.3708T较适合生长的范围。

2.2.1.4 pH对菌株生长的影响。tarim4生长所需pH为4.0～11.0，最适pH 8.5，而参照菌株Natrinema pellirubrum CGMCC 1.3708T生长所需的pH 6.0～8.0都可以生长。

2.2.1.5 抗生素敏感试验。菌株tarim4对杆菌肽、新生霉素敏感，对红霉素、新霉素、利福平、氯霉素、氨苄青霉素、诺氟沙星、链霉素、卡那霉素、四环素、万古霉素、制霉菌素、呋喃妥因、萘啶酸等不敏感。

2.2.2 碳、氮源利用。菌株tarim 4能利用果糖、麦芽糖、蔗糖、淀粉、甘油、甘露醇、D-山梨醇、醋酸盐、DL-乳酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、L-鸟氨酸、L-脯氨酸、L-谷氨酸盐等作为唯一碳源、能源生长，不能利用甘露糖、半乳糖、L-山梨糖、D-木糖、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-赖氨酸、L-丝氨酸、L-亮氨酸等;而相近菌株Natrinema pellirubrumCGMCC1.3708T能利用葡萄糖、半乳糖、L-山梨糖、D-木糖、DL-乳酸盐、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-鸟氨酸、L-丝氨酸等，不能利用甘露糖、果糖、D-核糖、阿拉伯糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、淀粉、甘油、甘露醇、D-山梨醇、醋酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、L-赖氨酸、L-脯氨酸、L-谷氨酸盐。它们在碳源、氮源的利用上存在差异。

2.3 基因型特征

2.3.1 16S rRNA基因。

2.3.1.1 16S rRNA基因扩增。采用古菌通用引物，对tarim4所提取的基因组DNA进行16S rRNA基因序列扩增且测序，得到几乎全长的16S rRNA基因序列，经过电泳检测，条带大小约为1.5 kb(图2)。序列提交NCBI，并获得登录号(JX44467)。

2.3.1.2 16S rRNA基因序列系统发育树分析。将tarim4的16S rRNA基因克隆测序结果上传至GenBank(登录号为JX44467)，序列大小为1 474 bp。将序列进行BLAST比对，再用MEGA5.0的Neighbor-jioning构建系统发育树。从图3可以看出，与该菌株嗜盐古菌钠线菌Natrinema属处于个分支。16S rRNA测序结果与有效发表的参比菌株钠线菌属Natrinema pallidum相似度为97%，为一个潜在新物种。

2.3.2 DNA的G+C mol% 含量测定。菌株tarim 4的基因组DNA中G+C含量为63.1%，相近菌株Natrinema pallidumG+C含量为63.1%，Natrinema altunense的G+C含量为63.1%。它们均属于高G+C的革兰氏阴性菌。

2.4 酶的纯化检测

2.4.1 微孔板法初筛碱性磷酸酶产生菌。采用磷酸苯二钠比色法，从实验室保存的86株极端嗜盐古菌筛选出具有碱性磷酸酶活性的菌株为8株(部分菌株)。经酶活测定，确定酶活力最高且较稳定的菌株为tarim4，故选该菌株进一步研究。

2.4.2 碱性磷酸酶的分离、纯化。经过硫酸铵沉淀、离子交换层析、凝胶过滤层析、纯化后的蛋白的SDS-PAGE电泳图出现单一条带，分子量约为45 kDa(图4)。

3 讨论

嗜盐微生物生长于高盐环境，根据其盐浓度不同可分为低度嗜盐、中度嗜盐、高度嗜盐。一般，盐浓度5% ～20%的为中度嗜盐微生物，大于20%的为极端嗜盐微生物。大量研究表明，嗜盐蛋白存在大量的酸性氨基酸如谷氨酸、天冬氨酸，大量的钠离子存在更有利于其肽链的折叠且维持其活性［9］。碱性磷酸酶来源非常广泛。到2013年，蛋白质数据库(PDB)约已存入66个碱性磷酸蛋白晶体结构图，并且在物种之间磷酸蛋白酶的氨基酸序列同源性很低(30%)，但其四级结构极大相似。Arai等［10］从中度嗜盐细菌盐单胞菌Halomonassp.593得到碱性磷酸酶蛋白晶体结构，并且从结构上分析该酶能在1～4 mol/L NaCl浓度范围都能发挥活性的原因。

该研究前期从硝尔库勒盐湖土样分离菌株，土样总盐为293 g/L，分离培养基中添加NaCl浓度达20%(W/V)。在碱性磷酸酶筛选过程中，选用的也是同一盐浓度。在86株嗜盐古菌中只筛到8株产碱性磷酸酶菌株，只有1株高产菌株。导致这个酶活筛选低的原因可能有两点:①磷酸苯二钠检测在该试验中检测灵敏度过低;②培养条件，有文献报道低浓度磷能诱导碱性磷酸酶的表达。该酶活性被胞内磷和胞外磷的浓度进行调节［4］。但是，在培养过程中，没有考虑到人工设计一个无磷或低磷环境。因此，无法判断这些保存的菌体是否能产碱性磷酸酶。灵敏的检测手段和无磷的培养条件将是我们继续开展碱性磷酸酶分离和纯化非常关键的步骤。

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