响应面法优化黄鲫蛋白抗菌液-葡萄糖美拉德反应的条件

阮关强，沈燕，韦荣编，宋茹

(浙江海洋学院食品与医药学院，浙江舟山316022)

抗菌肽(Antibacterial peptide)通常又被称为抗微生物肽或肽抗生素，是一种广泛存在于自然界中的具有抗菌、抗病毒，甚至抗肿瘤活性的多肽类。自第1个抗菌肽从惜古比天蚕蛹中被分离以来，研究者陆续从动植物中分离、纯化到不同种类的抗菌肽［1-2］。采用酶解法制备的黄鲫蛋白抗菌液(HAHp)不仅具有较强的抑菌性，而且还具有抗肿瘤和抗氧化生物活性［3-7］。但是，HAHp有一定的鱼腥味和苦味，对其今后广泛应用不利。前期研究发现美拉德修饰反应不仅能够提高黄鲫蛋白抗菌液的抑菌性，而且能够有效改善该抗菌液的风味性。笔者采用响应面分析法对黄鲫蛋白抗菌液和葡萄糖的美拉德反应条件进行优化处以期获得对水产品常见致病菌副溶血弧菌具有强抑菌作用的黄鲫蛋白抗菌液美拉德反应物，从而为黄鲫蛋白抗菌液在水产品中应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 黄鲫。黄鲫购于舟山水产市场。

1.1.2 指示菌。副溶血性弧菌(Vibrio parahemolyticus)，为浙江海洋学院食品与医药学院实验室保存菌种。

1.1.3 主要仪器及试剂。

1.1.3.1 主要仪器。恒温恒湿培养箱(上海慧泰仪器制造有限公司);台式PHS-3C精密pH计(上海虹益仪器仪表有限公司);立式压力蒸汽灭菌锅(上海博迅实业有限公司医疗设备厂);双列四孔恒温水浴锅(上海慧泰仪器制造有限公司)。

1.1.3.2 主要试剂。营养琼脂，购于杭州天和微生物试剂有限公司;胃蛋白酶，购于中国医药集团上海化学试剂公司;其他试剂均为市售分析纯。

1.2 方法

1.2.1 抑菌圈法。将副溶血性弧菌用肉汤液体培养基活化至对数生长期，取100 μl副溶血弧菌菌悬液加入灭菌培养皿中，然后加入45～50℃左右的营养琼脂培养基15 ml，混匀，待营养琼脂凝固后，用灭菌打孔器(内径8 mm)打孔，然后每孔加入经0.45 μm滤膜过滤除菌的样品液25 μl。将培养皿放置37℃培养箱中培养12 h，观察抑菌圈是否形成，并测量抑菌圈直径。每个样品平行测定2次，抑菌圈大小用平均值表示。

1.2.2 响应面法优化。在前期单因素试验的基础上，选择葡萄糖添加量、反应初始pH、加热时间和加热温度进行优化进行4因素3水平的Box-Behnken响应面分析试验(因素和水平设计见表1，试验方案设计见表2)，采用最小二乘方法对试验数据进行多项式回归分析，得到以下二次方方程:

其中y为响应值;α0为常数项;αj、αjj和 αij分别为一次项、平方和交互作用的回归系数;βi和βj为变量水平。采用Design Expert Software软件对试验数据进行统计分析，优化最佳的美拉德反应条件，然后在优化条件下进行验证试验，以判断优化反应条件是否合理。

2 结果与分析

2.1 Box-Behnken响应面分析试验结果 Box-Behnken响应面分析试验结果见表2。将表2中数据进行二次回归方程拟合，得到响应值与各因素间的二次回归方程为:Y=23.02+0.52X1+1.04X2+0.53X3-0.21X4+0.18X1X2+0.40X1X3-0.20X1X4-0.48X2X3+0.42X2X4+0.05X3X4+0.37X12+0.82X22+1.07X32+1.05X42。

表1 Box-Behnken响应面分析试验因素及水平

表2 Box-Behnken响应面分析试验设计及结果

方差分析结果表明，模型P值小于0.000 1，说明模型极显著;失拟项的P值大于0.05，说明失拟项不显著，且模型的相关系数R2为0.902 2，表示该模型条件能够很好地反映实际值。当P值小于0.05时，因素对响应值影响显著。由此可见，葡萄糖添加量、反应初始pH和加热时间对黄鲫蛋白抗菌液-葡萄糖美拉德产物的抑菌活性线性影响显著。虽然各因素间的交互作用对美拉德产物的抑菌活性影响不显著，但是通过因素间交互作用分析有助于揭示各因素间变化对美拉德产物抑菌活性的影响。因此，笔者进一步分析了因素间的交互作用对美拉德产物的抑菌活性的影响趋势。

从图1可以看出，在一定葡萄糖添加量下，反应初始pH的加大有利于黄鲫蛋白抗菌液-葡萄糖美拉德反应物的抑菌性增强，而当反应初始pH一定时，黄鲫蛋白抗菌液-葡萄糖美拉德反应物的抑菌圈直径随着葡萄糖添加量的加大而增加，说明葡萄糖添加量和反应初始pH对产物抑菌活性的增加有线性影响。从图2可以看出，当葡萄糖添加量一定时，美拉德反应产物的抑菌性先随着加热时间的增加而减少，此后随着加热时间的延长而逐渐地增强。从图3可以看出，无论在葡萄糖高添加量(如3%)还是低添加量(如0.8%)时，黄鲫蛋白抗菌液-葡萄糖美拉德产物的抑菌活性均随着加热温度的升高先减小后增加，说明加热时间和加热温度对鲫蛋白抗菌液-葡萄糖美拉德产物的抑菌性影响在特定加热时间和加热温度范围内具有一定线性影响。图4～6中各因素间交互作用也出现类似情况。黄鲫蛋白抗菌液-葡萄糖美拉德产物的抑菌性在两因素交互区间会出现最低值，说明黄鲫蛋白抗菌液与葡萄糖发生美拉德反应过程中，在特定条件下不利于产物抑菌活性的增加，可能与黄鲫蛋白抗菌液中抑菌活性物质发生改变或转化有关，因此在反应过程中要避开这些反应条件，如葡萄糖添加量1.0%、反应初始pH6.5、加热时间50 min和加热温度100℃等。

2.2 验证试验 采用Design Expert Software软件对得到的拟合方程进行分析，最终确定黄鲫蛋白抗菌液-葡萄糖美拉德反应的最佳条件为:葡萄糖添加量3%，反应初始pH为9.0，加热时间为100 min，加热温度为120℃。在此条件下得到的美拉德产物对指示菌副溶血弧菌的抑菌圈直径理论值达到28.6 mm，在优化反应条件下进行了3组平行试验，得到的美拉德反应产物对副溶血弧菌的抑菌圈平均直径为28.1 mm，与理论值非常接近，表明试验确定的优化条件是合理的。

3 小结

响应面分析试验有效优化了黄鲫蛋白抗菌液-葡萄糖美拉德反应条件，以美拉德产物对副溶血弧菌的抑菌性为响应值，确定最佳美拉德反应条件为:葡萄糖添加量3%，反应初始pH为9.0，加热时间为100 min，加热温度为120℃。

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