发酵海产品中微生物形成挥发性代谢产物研究进展

李 莹，白凤翎，励建荣

（渤海大学食品科学研究院，辽宁省食品安全重点实验室，食品贮藏加工及质量安全控制工程技术研究中心，辽宁 锦州 121013）

发酵海产品中微生物形成挥发性代谢产物研究进展

李 莹，白凤翎*，励建荣

（渤海大学食品科学研究院，辽宁省食品安全重点实验室，食品贮藏加工及质量安全控制工程技术研究中心，辽宁 锦州 121013）

挥发性代谢产物一般是由原料和微生物的酶类降解海产品中蛋白质、脂类等大分子形成的小分子物质，对产品品质和风味形成具有十分重要的作用。本文对发酵海产品中形成挥发性代谢产物的微生物类群、挥发性代谢产物的代谢途径和形成过程进行综述，阐明微生物、代谢途径与代谢产物三者之间的内在联系，为发掘和利用发酵海产品中优良的微生物类群，提升产品品质提供借鉴与参考。

海产品；发酵；微生物；挥发性代谢产物

发酵海产品是以新鲜鱼、虾、蟹、贝类等为主要原料，通过添加20%～30%高剂量食盐经过较长时间微生物发酵而成的产品，主要包括虾油、虾酱、鱼酱油、鱼露等［1-2］。在酿制过程中，来自原料本身和微生物产生的各种酶类将海产品中的蛋白质、脂肪和碳水化合物等大分子物质降解形成氨基酸、脂肪酸和单糖等小分子代谢产物。同时，微生物还可利用这些代谢产物进行初级代谢和次级代谢过程，形成各种挥发性代谢产物（microbial volatile organic compounds，MVOCs），主要包括醇类、醛类、酮类、酯类和芳香族化合物以及一些含硫化合物、链烷、链烯、呋喃、吡嗪、吡咯类化合物等［3］。MVOCs不仅综合赋予发酵海产品所特有的风味，而且对其品质起到决定性的烘托作用。例如，鱼酱中的醛类、醇类和酯类风味物质赋予产品以肉香和奶酪香气，虾酱具有独特烤香味的主要挥发性物质则是吡嗪类的含氮杂环化合物［4］。海产品发酵过程中微生物的多样性和代谢途径的多样性决定了MVOCs的复杂性和差异性，因此，分析与掌握发酵主体微生物菌相构成和代谢产物的形成途径，对发酵过程产品风味形成机制、提升产品品质具有十分重要的实际意义。本文对发酵海产品中挥发性代谢产物的主要类型、来源、代谢途径和形成过程进行分析，为深入挖掘微生物对发酵海产品品质的作用机制奠定理论基础。

1　MVOCs的主要类型及来源

近年来，对发酵海产品中挥发性物质的研究较多集中在鱼类发酵产品，包括中国的鱼露、日本的鱼酱油和鱼酱以及泰国的鱼酱等［5-7］。研究表明：虽不同种发酵产品中挥发性物质的含量存在较大差异，但其种类却几乎相同，主要包括醇类、醛类、酮类、酸类、酯类、芳香族和一些含硫、含氮化合物。表1是发酵食品中MVOCs的主要类型和来源，从中可以看出，细菌是MVOCs形成的主体微生物类群，其中乳酸菌是多种挥发性物质的主要来源；其次是酵母，且多为酿酒酵母。在发酵过程中，伴随着菌体生物量的增加，微生物将逐步释放分解蛋白质、脂肪和碳水化合物等生物大分子的各种酶类，形成的初级代谢产物作为微生物代谢的前体底物，经过一系列复杂的代谢过程，如氨基酸代谢、醇氧化反应、有机酸代谢、脂肪酸代谢、酯化反应以及美拉德反应等形成具有挥发性的次级代谢产物即MVOCs［8-10］。

表1　发酵食品中MOVCs的主要类型及来源Table 1 Major species of MOVCs produced by microorganisms in fermented foods oods

由表1可知，微生物的多样性、代谢途径的复杂性致使代谢产物的多样性，从而使不同产品呈现不同的风味特征。不同发酵海产品均具有自身独特的香气特征。如泰国鱼酱中嗜盐四联球菌（Tetragenococcus halophilus）的发酵作用赋予其具有焦糖和水果香气，而鱼露中的芽孢杆菌、棒状杆菌以及少量假单胞菌和红色极端嗜盐古细菌却使其具有氨味、鱼味、坚果及奶酪香气［17-18］。

大量研究表明，发酵海产品中的香味物质来自于微生物形成的挥发性次级产物，当腌鱼调料添加抗生素或防腐剂时，产品既不会呈现典型的芳香气味，也不含有较高含量的挥发性脂肪酸（volatile fatty acid，VFA）。如此说明VFA不是脂肪酸氧化的产物，而是嗜盐菌的次级代谢产物。醇类、酮类、醛类以及酸类等次级代谢产物是发酵海产品中香味挥发性物质的来源，是由嗜盐菌氨基酸、寡肽等初级代谢产物进一步分解产生的。如亮氨酸异化作用的代谢产物2-甲基丁醛、3-甲基丁醛和3-甲基丁醇是芝士风味及肉香味的挥发性成分［19］。泰国鱼酱中的嗜盐乳酸菌有助于醇类的积累，也会在其生长过程中产生少量的乙酸乙酯和不同含量的丙酮、2-丁酮、2，3-丁二酮和环己酮等挥发性成分，其中，菌株Tetragenococcus halophilus MS33、MRC5-5-2和MCD10-5-15有利于2-甲基丙醛的形成，菌株MRC10-1-3有利于苯丙醛形成［7］。

2　MVOCs的代谢形成途径

发酵过程中，原料被微生物降解形成葡萄糖、氨基酸、脂肪酸等初级代谢产物，它们可作为微生物代谢形成挥发性次级代谢产物的前体物质，也为微生物生长代谢提供能量来源。图1是发酵海产品中MVOCs的代谢形成途径，其中圈内为原料中营养成分和初级代谢产物，圈外为不同种类的挥发性次级代谢产物［14］。从图中可以看出，原料中蛋白质、碳水化合物和脂类在水解酶的作用下形成单糖、氨基酸和脂肪酸，其中单糖或经EMP途径、三羧酸循环（tricarboxylic acid cycle，TCA）和氨基酸代谢途径形成氨基酸，作为MVOCs形成的小分子前体物质。

图1　发酵海产品中MVOCs的代谢形成途径［1144］Fig.1 Major pathways for the production of MVOCs by microorganisms［14］

2.1单糖代谢途径

葡萄糖和半乳糖等单糖既可经EMP途径形成醇类物质乙醇，也能够以单糖的中间代谢产物乙酰辅酶A作为底物经脂肪酸合成途径形成乙酸、丙酸、丁酸等挥发性酸类次级代谢产物。

2.2氨基酸代谢途径

氨基酸分解代谢主要分为两条途径，一是分解后形成乙醇、2-甲基-1-丙醇和2-苯乙醇等醇类次级代谢产物，这些醇类物质可进一步形成乙醛、丙醛等醛类产物，或经醇脱氢和醛脱氢途径形成挥发性酸，也可通过乙酰转移酶作用产生乙酸乙酯和异丁酸乙酯等酯类代谢产物；二是芳香族氨基酸经分解形成苯甲醛和苯乙醛等芳香醛类产物，进一步氧化形成苯甲酸和苯乙酸等芳香酸类产物。

2.3脂肪酸代谢途径

脂肪酸代谢途径主要为两条途径，一是经脂肪氧化途径形成己醛、2-己烯醛和1-辛烯-3-醇等C6和C8的醛醇类，二是经硫醇酯水解途径形成2-庚酮、2-戊酮等酮类代谢产物。

由此看来，微生物代谢途径的复杂多样性决定了发酵代谢产物的多样性。

3　主要MVOCs及形成过程

3.1醇类MVOCs

醇类MVOCs存在于多种发酵海产品中，如泰国鱼酱、日本鱼露和鱼酱油均含有乙醇、3-甲基-1-丁醇等多种醇类。其中，乙醇等短直链醇的感官阈值较高，对产品的风味贡献很小。相反，五碳以上直链醇和支链醇感官阈值较低，对产品具有一定的呈香作用。如广泛存在于发酵鱼类产品中的1-辛烯-3-醇具有蘑菇香气［6］。

发酵海产品中醇类MVOCs的生成途径复杂多样，如乙醇的形成可分为酵母发酵和细菌发酵两条途径，两者主要在于葡萄糖形成丙酮酸的途径，即糖代谢途径的不同。酵母途径中葡萄糖经EMP途径产生丙酮酸，细菌途径则是由2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖途径形成丙酮酸，所产生的丙酮酸同经丙酮酸脱羧酶脱羧生成乙醛，进而被还原为乙醇。此外，脂肪酸经脂肪氧化作用以及氨基酸分解作用也是形成醇的主要途径［20］。例如3-甲基-1-丁醇是通过Ehrlich反应将游离的亮氨酸进行氧化脱氨基后形成的［18］。

3.2醛酮类MVOCs

醛酮类MVOCs是发酵海产品中重要的呈香成分，主要包括乙醛、丙醛、2-甲基丁醛和3-甲基丁醛以及（E，E）-2，4-庚二烯醛等不饱和脂肪醛，它们通常赋予产品以果香、坚果香、辛辣刺激性气味以及清香和鱼类香气［5-6］。同时，存在的酮类物质如2，3-丁二酮（又名双乙酰）呈奶油、乳酪香气，6-甲基-5-庚烯-2-酮有甜香及果香［20］。

醛类物质的形成途径有3 条：一是不饱和脂肪酸的氧化；二是脂肪氧化初始产物即脂质氢过氧化物和过氧化物的分解；三是通过氨基酸的降解反应生成［21］。发酵海产品中的六碳醛和八碳醛主要是由脂肪酸经脂肪氧化酶氧化后，再经氢过氧化物裂解酶作用生成。壬醛和癸醛源于亚麻酸、亚油酸和花生四烯酸等不饱和脂肪酸的氧化作用［22-23］。在发酵肉酱产品中，醛类物质一般通过氨基酸的降解反应生成［24］。

酮类物质的形成途径与醛类物质相似，包括其中的第一条和第三条途径。早在1971年，Thomas等［25］就指出甲基酮的形成来自于不饱和脂肪酸的氧化。此外，在一般情况下，霉菌和一些嗜热乳酸球菌经EMP途径也可以形成酮类物质--双乙酰。在日本发酵鱼酱油中，双乙酰是对其风味有显著影响的一种挥发性物质，能够增加产品的甜香味。

3.3酸类MVOCs

酸类MVOCs在发酵食品中主要呈现乳酪香气，也是发酵酱类海产品中的主要呈味成分。酸类物质可以促进发酵海产品感官风味的合成，从而提升产品风味的复杂性［26-27］。在不同发酵酱类海产品中共发现了乙酸、2-甲基丙酸、丁酸、2-甲基丁酸和3-甲基丁酸等5 种挥发性脂肪酸，而在日本鱼酱油中并未发现乙酸和丁酸。

酸类MVOCs主要由脂肪酶水解途径，醇脱氢酶和醛脱氢酶醇转化途径和糖类物质合成脂肪酸途径等代谢途径形成。来自发酵酱类海产品的5种挥发性脂肪酸中，乙酸一是来自于微生物的糖代谢途径，由糖代谢的乙酰辅酶A经脂肪酸合成酶作用缩合而成；二是经乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶 将乙醇转化为乙醛，乙醛进一步转化成乙酸［14］。

3.4酯类MVOCs

酯类物质被发现存在于大多数发酵海产品中［4］。脂肪酸乙酯是增加成品海产调味品香气的最主要的物质。由于其具有较低的阈值，存在于日本鱼酱油中的大多数酯类都能赋予食品甜香及果香，特别是戊酸乙酯、乙酸异戊酯、己酸乙酯［6］。

酯类物质的形成途径有两条：一是发酵过程中由微生物产生的酯化酶催化生成；二是由有机酸和醇通过非酶催化的酯化反应生成。例如，2-甲基丙酸甲酯、2-甲基丁酸甲酯和3-甲基丁酸甲酯可能是微生物代谢支链氨基酸生成相应甲基酸后的甲酯化产物。

3.5硫化物类MVOCs

已在多种发酵鱼酱产品中发现呈现熟白菜香气 的二甲基二硫和肉香及洋葱香气的二甲基三硫，因这些含硫MVOCs具有较低的阈值，对产品的风味贡献很大，是重要的香气物质［28］。硫化物类MVOCs主要来自于原料中蛋氨酸的降解，或由海产品肌肉组织中的谷胱甘肽转化形成。此外，研究发现某些体现肉香味的硫化物的形成取决于发酵基质的p H值，如Ho fmann等［29］发现随着pH值的降低，半胱氨酸和核糖反应产生的2-甲基-3-呋喃硫醇的产量会逐渐增加。3-甲硫基丙醛是在氨基转移酶和α-酮酸脱羧酶作用下形成蛋氨酸的斯特雷克醛，它赋予产品肉香及熟洋葱的香气，微生物可将其进一步转化为3-甲硫基-1-丙醇，二者均在多种日本鱼酱油中被检出［6］。

3.6吡嗪类MVOCs

吡嗪类MVOCs是一种含氮的杂环化合物，在一些发酵海产鱼类品主要含有2，5-二甲基吡嗪、2，6-二甲基吡嗪和三甲基吡嗪和四甲基吡嗪。虽然它们的含量较小，却能给产品贡献重要的烤香及坚果香气。其中，2，5-二甲基吡嗪和2，6-二甲基吡嗪具有烤香和肉香，三甲基吡嗪具有烤面包香气，四甲基吡嗪呈现发酵豆香。食品中吡嗪类MVOCs主要来源于发酵过程中糖与蛋白质或氨基酸的美拉德反应，谷氨酸棒状杆菌等微生物也能利用氨基酸合成吡嗪类次级代谢产物［16，30］。

3.7芳香类MVOCs

芳香类MVOCs是发酵海产品中十分重要的香气成分，对产品风味具有决定性作用。产品中几乎都含有苯甲醛、苯乙醛、苯乙醇以及苯酚、苯乙酮等芳香族化合物，其中苯甲醛有苦杏仁气息，苯乙醛呈现强烈的风信子香气以及似绿叶的清香，苯乙醇可给产品贡献甜味和花香［31］。而酚类物质所呈现的香气具有活性强、特征明显的优点，对虾酱典型的酱香形成具有较大的贡献。芳香类MVOCs主要来自于芳香族氨基酸分解代谢的产物，如苯乙醛是由海产品中微生物降解苯丙氨酸形成的［32］。

4　结 语

早在20世纪70年代，发酵微生物具有形成MVOCs的能力已被确认，对MVOCs也有了一定的认识［33-37］。迄今为止，国内外对发酵海产品的研究包括发酵微生物的种类及其功能，发酵剂对产品品质的影响分析等方面。而对产品中挥发性呈香物质研究集中在MVOCs的分析鉴定，对其形成的代谢途径研究报道鲜见。

随着分子生物学技术的快速发展，如特异性片段测序及分析技术、遗传指纹图谱分析技术和宏基因组分析技术在发酵食品微生物生态学的广泛应用，对海产品发酵过程中微生物菌群发生、发展与演变分析与鉴定越来越全面精确。同时，色谱、电泳、质谱和核磁共振等对微生物代谢产物的分析技术日臻成熟，为探究发酵微生物与MVOCs的内在联系，揭示微生物次级代谢产物形成途径奠定基础。深入研究发酵海产品中MVOCs的构成以及相应的微生物类群和代谢途径有助于探究发酵机制，从而提升和改善发酵海产品品质，对发酵海产品的研究与应用具有重要作用与意义。

［1］ JUNG J Y， LEE S H， LEE H J， et al. Microbial succession and metabolite changes during fermentation of saeu-jeot： traditional Korean salted seafood［J］. Food Microbiology， 2013， 34（2）： 360-368.

［2］ RHEE S J， LEE J E， LEE C H. Importance of lactic acid bacteria in Asian fermented foods［J］. Microbial Cell Factories， 2011， 10（Suppl 1）：10066-10071.

［3］ LINTON C J， WRIGHT S J L. Volatile organic compounds：microbiological aspects and some technological implications［J］. Journal of Applied Microbiology， 1993， 75（1）： 1-12.

［4］ CHA Y J， CADWALLADER K R. Volatile components in saltfermented fish and shrimp pastes［J］. Journal of Food Science， 1995，60（1）： 19-24.

［5］ JIANG Jinjin， ZENG Qingxiao， ZHU Zhiwei. Analysis of volatile compounds in traditional Chinese fish sauce （Yu Lu）［J］. Food and Bioprocess Technology， 2011， 4（2）： 266-271.

［6］ GIRI A， OSAKO K， OHSHIMA T. Identification and characterisation of headspace volatiles of fish miso， a Japanes e fish meat based fermented paste， with special emphasis on effect of fish species and meat washing［J］. Food Chemistry， 2010， 120（2）： 621-631.

［7］ UDOMSIL N， RODTONG S， TANASUPAWAT S， et al. Proteinaseproducing halophilic lactic acid bacteria isolated from fish sauce fermentation and their ability to produce volatile compounds［J］. International Journal of Food Microbiology， 2010， 141（3）： 186-194.

［8］ WANAKHACHOMKRAL P， LERTSIRI S. Comparison of determination method for volatile compounds in Thai soy sauce［J］. Food Chemistry， 2003， 83（4）： 619-629.

［9］ CHUNG H Y. Volatile components in fermented soybeans （Glycine max） curds［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 1999，47（7）： 2690-2696.

［10］ SHIMODA M， PERALTA R R， OSAJIMA Y. Headspace gas analysis of fish sauce［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 1996，44（11）： 3601-3605.

［11］ DICKINSON J R， SALGADO L J， HEWLINS J E. The catabolism of amino acids to long chain and complex alcohols in Saccharomyces cerevisiae［J］. The Journal of Biological Chemistry， 2003， 278（10）：8028-8034.

［12］ TAVARIA F K， DAHL S， CARBALLO F J， et al. Amino acid catabolism and generation of volatiles by lactic acid bacteria［J］. Journal of Dairy Science， 2002， 85（10）： 2462-2470.

［13］ TABASCO R， FONTECHA J， REQUENA T， et al. Competition mechanisms of lactic acid bacteria and bifidobacteria： f ermentative metabolism and colonization［J］. LWT-Food Science and Technology，2014， 55（2）： 680-684.

［14］ 梁华正， 张燮， 饶军， 等. 微生物挥发性代谢产物的产生途径及其质谱检测技术［J］. 中国生物工程杂志， 2008， 28（1）： 124-133.

［15］ CHENG Heya. Volatile flavor compounds in yogurt： a review［J］. Critical Review in Food Science and Nutrition， 2010， 50（10）： 938-950.

［16］ 陈向荣， 梁盛年. 微生物与天然风味化合物的生产［J］. 西江大学学报， 1997（3）： 47-52.

［17］ VENTOSA A， NIETO J J， OREN A. Biology of moderately halophilic aerobic bacteria［J］. Microbiology and Molecular Biology Reviews，1998， 62（2）： 504-544.

［18］ GIRI A， OSAKO K， OKAMOTO A， et al. Olfactometric characterization of aroma active compounds in fermented fish paste in comparison with fish sauce， fermented soy paste and sauce products［J］. Food Research International， 2010， 43（4）： 1027-1040.

［19］ MASSON F， HINRICHSEN L， TALON R， et al. Factors influencing leucine catabolism by a strain of Staphylococcus carnosus［J］. International Journal of Food Microbiology， 1999， 49（3）： 173-178.

［20］ GIRAND B， DURANCE T D. Headspace volatiles of sockeye and pink salmon as affected by retort process［J］. Journal of Food Science，2000， 65（1）： 34-39.

［21］ SINK J D. Lip id soluble components of meat flavors/odors and theirbiochemical origin［J］. Journal of the American Oil Chemists' Society，1973， 50（11）： 470-474.

［22］ BERGER R G. Flavours and fragrances［M］. Heidelberg： Springer-Verlag Press， 2007： 135-187.

［23］ MEYNIER A， NOVELLI E， CHIZZOLINI R， et al. Volatile compounds of commercial Milano salami［J］. Meat Science， 1999，51（2）： 175-183.

［24］ DOUGAN J， HOWARD G E. Some flavoring constituents of fermented fish sauces［J］. Journal of the Science of Food and Agriculture， 1975， 26（7）： 887-894.

［25］ THOMAS C P， DIMICK D S， MCNEIL J H. Sources of flavor in poul try skin［J］. Food Technology， 1971， 25（4）： 109-115.

［26］ SUNESEN L O， DORIGONIB V， ZANARDI E， et al. Volatile compounds released during ripening in Italian dried sausage［J］. Meat Science， 2001， 58（1）： 93-97.

［27］ MATEO J， ZUMALACARREGUI J M. Volatile compounds in chorizo and their changes during ripening［J］. Meat Science， 1996，44（4）： 255-273.

［28］ LANDAUD S， HELINCK S， BONNARME P. Formation of volatile sulfur compounds and metabolism of methionine and other sulfur compounds in fermented food［J］. Applied Microbiology and Biotechnology， 2008， 77（6）： 1191-1205.

［29］ HOFMANN T， SCHIEBERLE P. Quantitative model studies on the effectiveness of different precursor systems in the formation of the intense food odorants 2-furfurylthiol and 2-methyl-3-furanthiol［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 1998， 46（1）： 235-241.

［30］ van BOEKEL M A J S. Formation of flavour compoun ds in the Maillard reaction［J］. Biotechnology Advances， 2006， 24（2）： 230-233.

［31］ 李明浩， 胡璇， 夏延斌. 剁椒坯盐水酱油与普通酱油香气特征比较分析［J］. 食品与机械， 2011， 27（5）： 58-62.

［32］ MARILLEYL， CASEY M G. Flavours of cheese products： metabolic pathways， analytical tools and identification of producing strains［J］. International Journal of Food Microbiology， 2004， 90（2）： 139-159.

［33］ 张薇， 程政红， 刘云国， 等. 植物挥发性物质成分分析及抑菌作用研究［J］. 生态环境， 2007， 16（5）： 1455-1459.

［34］ KNUDSEN G K， BENGTSSON M， KOBRO S， et al. Discrepancy in laboratory and field attraction of apple fruit moth Argyresthia conjugella to host plant volatiles［J］. Physiological Entomology， 2008，33（1）： 1-6.

［35］ FREEMAN L R， SILVERMAN G L， ANGELINI P， et al. Volatiles produced by microo rganisms isolated from refrigerated chicken at spoilage［J］. Applied and Environmental Microbiology， 1976， 32（2）： 222-231.

［36］ STANLEY G， SHAW K J， EGAN A F. Volatile compounds associated with spoilage of vacuum-packaged sliced luncheon meat by Brochothrix thermosphacta［J］. Applied and Environmental Mi crobiology， 1981， 41（3）： 816-818.

［37］ SCHULZ S， DICKSCHAT J S. Bacterial volatiles： the smell of small organisms［J］. Natural Product Reports， 2007， 24（4）： 814-842.

Advances in Research Microbial Volatile Organic Compounds from Fermented Seafood

LI Ying， BAI Fengling*， LI Jianrong
（Engineering and Technology Research Center of Food Preservation， Processing and Safety Control of Liaoning Province，Liaoning Province Key Laboratory of Food Safety， Food Science Research Institute， Bohai University， Jinzhou 121013， China）

Microbial volatile organic compounds （MVOCs） encompass various small molecular substances produced by the degradation of protein and lipid during microbial fermentation. The enzymes from raw materials and microorganisms are involved in the process of degradation. MVOCs are very important for quality and flavor formation. In this paper， the production， metabolic pathways and formation process of MVOCs are revi ewed. The intrinsic connections among the microbes， metabolic pathways and metabolites are elucidated in order to provide guidelines and

to discover and apply good microbes from fermented seafood for improving product quality.

seafood； fermentation； microorganisms； volatile organic compounds

TS254.5

A

1002-6630（2015）15-0255-05

10.7506/spkx1002-6630-201515047

2014-11-04

“十二五”国家科技支撑计划项目（2012BAD29B06）；辽宁省高校重大科技平台开放课题（LNSAKF2011011）

李莹（1987—），女，硕士研究生，研究方向为水产品贮藏与加工。E-mail：lylf11521@163.com

白凤翎（1964—），男，教授，博士，研究方向为食品质量与安全控制和食品微生物学。E-mail：baifling@163.com