马克斯克鲁维酵母Y51-6发酵稀奶油工艺优化及挥发性风味成分分析

王 丹，李 伟，芮 昕，马宇潇，徐 笑，黄 璐，吴 寒，董明盛*

（南京农业大学食品科技学院，江苏 南京 210095）

马克斯克鲁维酵母Y51-6发酵稀奶油工艺优化及挥发性风味成分分析

王 丹，李 伟，芮 昕，马宇潇，徐 笑，黄 璐，吴 寒，董明盛*

（南京农业大学食品科技学院，江苏 南京 210095）

利用马克斯克鲁维酵母Y51-6发酵稀奶油，以酒精体积分数、感官评定作为优化指标，通过正交试验确定优化发酵工艺。最佳发酵工艺条件为：发酵时间40 h，发酵温度45 ℃，蔗糖添加量7 g/100 mL，接种量7%（体积分数）。并对发酵过程进行动态追踪，0～12 h内酵母菌生长处于延滞期，12～24 h为对数期，发酵24～32 h为稳定期，32 h之后酵母菌生长进入衰亡期。发酵过程中pH值逐渐降低，酸度逐渐升高，酒精体积分数逐渐增加，色值变化不明显。采用固相微萃取结合气相色谱-质谱联用技术检测稀奶油发酵前后产生的挥发性风味成分。结果表明：未经发酵的稀奶油中共检测出17 种主要成分，主要成分为2-庚酮、2-壬酮等甲基酮类化合物。而经发酵的稀奶油样品中共检测出35 种主要成分，甲基酮类化合物比例降低，苯乙醇等醇类物质、己酸乙酯等酯类物质明显增多。

马克斯克鲁维酵母；稀奶油；工艺优化；固相微萃取-气相色谱-质谱法

食品的香味是食品的重要品质之一，食用香精香料的产生极大地丰富了食品的香味。食用香精香料现广泛应用于食品生产的各个领域，原因在于食用香精香料不仅可以改善食品品质，增加食品香味，还可以降低生产成本，提高人们的生活品质，促进现代食品工业快速发展［1］。目前，可以通过物理制备法、热反应制备法、生物技术制备法制备香精香料，其中酶法以及微生物法制备香精香料最具实际应用价值［2］。

马克斯克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus）生长速率较快，具有耐热性，并具有吸收各种糖类的能力，还可以分泌各种酶并具有产乙醇的能力，这些特点使得它适合工业生产［3］。将马克斯克鲁维酵母在特定的环境条件下培养发酵，会产生对人体有益的多种有机物质，如小分子肽、微量元素、矿物质、维生素等，还会产生一些风味物质，如醇类物质、酯类物质等［4-5］。

目前，对香气组分的分析多采用气相色谱法（gas chromatography，GC）或用溶剂萃取后进行气相色谱-质谱联用分析［6］。固相微萃取技术（solid-phase microextraction，SPME）是一项新型分析前处理技术，具有无需溶剂、灵敏度高、取样灵活、操作方便等特点，可直接与气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）等联用［7-9］。

本实验利用分离来自赛里木酸奶中的马克斯克鲁维酵母Y51-6（以下简称为Y51-6），以市售稀奶油作为原料，以感官评定、酒精体积分数为指标进行工艺优化。按照优化工艺发酵稀奶油，并采用顶空固相微萃取和气相色谱-质谱联用技术（SPME-GC-MS）对发酵前后的挥发性风味成分进行比较分析，以期获得香味浓郁、令人愉悦的风味物质，并为获得新型食品增香剂提供一定的参考。

1　材料与方法

1.1材料与菌种

稀奶油 青岛雀巢有限公司；白砂糖 市售。

Kluyveromyces marxianus Y51-6 南京农业大学食品科技学院食品微生物实验室保存菌种。

1.2仪器与设备

PTHW型调温控温电热套 巩义市予华仪器有限责任公司；HH-2型数显恒温水浴锅 常州国华电器有限公司；Bruker 320-MS气相色谱/质谱联用仪、SPME手动进样手柄、50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取头上海安谱科学仪器有限公司；DHP-9012型电热恒温培养箱 上海一恒科学仪器有限公司；JY502型电子天平上海浦春计量仪器有限公司；CR-400型色差计 日本Konica Minolta公司。

1.3方法

1.3.1指标测定

1.3.1.1感官评价［10-13］

设置感官评价总分为100 分，由食品学院10 名经过培训的、具有一定感官评价经验的硕士研究生担任品评员，按照表1中感官评分标准的要求，对发酵产品分别从色泽、气味、滋味、组织状态、总体评定等5 个方面进行感官评价。

表1　感官评价标准Table 1 Standards for sensory evaluation

1.3.1.2酒精体积分数的测定

采用蒸馏比重法进行测定［14］。

1.3.1.3pH值和酸度的测定

pH值采用pH计测定。

按照GB 5413.34-2010《食品安全国家标准 乳和乳制品酸度的测定》［15］规定的方法进行。称取10 g（精确到0.001 g）已混匀的稀奶油，加30 mL中性乙醇-乙醚混合液，混匀，用NaOH标准溶液电位滴定至pH 8.3为终点。根据滴定体积计算酸度。

1.3.1.4生长曲线的测定

参考GB 4789.15-2010《食品安全国家标准 食品微生物学检验 霉菌和酵母计数》［16］进行生长曲线的测定。

1.3.1.5色值的测定

应用色差计测试产品发酵前后的亮度（L*值）、红度（a*值）和黄度（b*值）。每组样品随机取点测定，3 次重复取平均值。

1.3.2Y51-6发酵稀奶油工艺优化

1.3.2.1Y51-6发酵稀奶油单因素试验

发酵时间的确定：按照5%（体积分数，下同）的比例将Y51-6接种于稀奶油中，加糖量为4 g/100 mL，于42 ℃条件下分别培养24、32、40、48、56 h，测定酒精体积分数并进行感官评定。

发酵温度的确定：按照5%的比例将Y51-6接种于稀奶油中，加糖量为4 g/100 mL，分别于28、31、34、37、42、45 ℃培养48 h，测定酒精体积分数并进行感官评定。

加糖量的确定：按照5%的比例将Y51-6接种于稀奶油中，加糖量分别为0、2、4、6、8 g/100 mL，于42 ℃培养48 h，测定酒精体积分数并进行感官评定。

酵母接种量的确定：分别按照1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%的接种量将Y51-6接种于稀奶油中，加糖量为4 g/100 mL，于42 ℃条件培养48 h，测定酒精体积分数并进行感官评定。

1.3.2.2Y51-6发酵稀奶油正交试验

在单因素试验基础上，选用L9（34）正交试验表，以感官评价为指标进行优化，判定最佳工艺条件。

1.3.3SPME-GC-MS检测挥发性风味成分

SPME条件：称取20 g待测样品放入50 mL锥形瓶。将50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相萃取头在使用前于280 ℃老化1 h。

GC条件：TRACE TR-5色谱柱（30 m×0.25 mm，1 μm）。升温程序：起始50 ℃，保持5 min；以4 ℃/min升温至230 ℃，保持5 min。载气：高纯氦气，载气流速：1.0 mL/min。

MS条件：电离方式EI+，进样孔温度为250 ℃，离子源温度为250 ℃，电离电压为70 eV，扫描范围为m/z：33～450。

定性与定量：将检测到的质谱信息利用NIST和Wiley数据库信息进行比对，正反匹配度均大于700的物质作为定性结果。采用峰面积归一法计算各组分的相对含量。

2　结果与分析

2.1Y51-6发酵稀奶油单因素试验结果

2.1.1发酵时间的确定

图1　不同发酵时间对稀奶油的影响Fig.1 Effect of fermentation time on alcohol content and sensory score

产品在发酵初期时只有稀奶油的香气，醇味非常微弱，然而当发酵时间达到24 h后，可以闻到沁人心脾的醇香味。由图1可知，随着发酵时间的延长，发酵产品的酒精体积分数也随之增加。但从感官评分结果来看，产品在32 h达到最佳，再往后，感官评分开始下降，可能是因为在发酵的后期产生了很多其他的代谢产物，影响了产品的感官品质，除此之外，发酵后期会产生大量的CO2，导致刹口感强烈，一定程度上也影响了产品的感官。另外考虑到发酵时间对工厂效益有很大影响，缩短发酵时间能够直接有效地节约资源。故确定32 h为最佳发酵时间。

2.1.2发酵温度的确定

图2　不同发酵温度对稀奶油的影响Fig.2 Effect of fermentation temperature on alcohol content and sensory score

卢鑫［17］的研究结果表明，马克斯克鲁维酵母L-6最适生长温度为36 ℃。而本研究中，如图2所示，在30～42℃范围内，随着发酵温度的升高，稀奶油的感官评分、酒精体积分数逐渐升高，42 ℃时感官评分与酒精体积分数达到最高，这与马克斯克鲁维酵母是高温酵母菌［18］有关，随着温度升高，其代谢活动加快。之后感官评分、酒精体积分数开始降低。这是因为控制合适的温度至关重要，虽然在稍高于最适温度的条件酵母菌下生长速率较快，但在较高的温度下酵母菌易老化，因此确定发酵温度在42 ℃左右为宜。

2.1.3蔗糖添加量的确定

图3　不同蔗糖添加量对稀奶油的影响Fig.3 Effect of sucrose concentration on alcohol content and sensory score

由图3可知，随着蔗糖添加量的增加，稀奶油的感官评分以及酒精体积分数逐渐增高，可能是因为随着蔗糖添加量的增大，促进了马克斯克鲁维酵母的生长，但是当蔗糖添加量为8 g/100 mL时，此时酒精体积分数最高，然而口感过甜，使得感官评分下降明显。故从酒精体积分数和感官评分综合考虑，确定蔗糖添加量在6 g/100 mL左右为宜。

2.1.4接种量的确定

由图4可知，随着接种量增加，稀奶油的酒精体积分数不断增加，在接种量为7%时达到最高，由于酵母发酵利用糖类物质作为碳源，接种量需要控制在合理的范围之中，接种量低，细菌不能充分利用这些碳水化合物，接种量过高，糖类不能满足需求。因此，只有合适的接种量，才能使糖的作用发挥到最大。并且当接种量为6%时，感官评分也是最高的，所以选择接种量为6%。

图4　不同接种量对稀奶油的影响Fig.4 Effect of inoculation amount on alcohol content and sensory score

2.1.5正交试验设计与结果分析

表2　L 2 L9（334）正交试验设计方案与结果Table 2 Experimental design and results of orthogonal tests

正交试验结果如表2所示，从极差大小可以看出，各种因素对酒精体积分数的影响次序依次为：A＞C＞B＞D，即发酵时间＞蔗糖添加量＞发酵温度＞接种量。各种因素对感官评分的影响次序依次为：A＞B＞C＞D，即发酵时间＞发酵温度＞蔗糖添加量＞接种量。

使酒精体积分数最高的最优组合为A3B3C3D3，即发酵时间40 h，发酵温度45 ℃，蔗糖添加量7 g/100 mL，接种量7%。使感官评分达到最高的最优组合为A2B2C3D3，即发酵时间32 h，发酵温度42 ℃，蔗糖添加量7 g/100 mL，接种量7%。

2.1.6配方的优化组合及验证性实验

根据正交试验所得结果，对于酒精体积分数优化工艺条件为：发酵时间40 h，发酵温度45 ℃，蔗糖添加量7 g/100 mL，接种量7%。在此优化条件下进行验证性实验，得到酒精体积分数为2.6%，感官评分为86.0。对于感官评分的优化工艺条件为：发酵时间32 h，发酵温度42 ℃，蔗糖添加量7 g/100 mL，接种量7%。在此优化条件下进行验证性实验，得到酒精体积分数为1.5%，感官评分为84.3。综合酒精体积分数和感官评分的结果，取发酵时间40 h，发酵温度45 ℃，蔗糖添加量7 g/100 mL，接种量7%作为后续发酵条件。

2.2Y51-6发酵过程动态追踪

图5　Y51-6发酵稀奶油产品图像Fig.5 Pictures of cream fermented by Kluyveromyces marxianus Y51-6

由图5可知，产品在发酵过程中会产生越来越多的气泡。在发酵24 h时，可见些许气泡，而当发酵达到32 h之后，稀奶油会产生大量气泡。这与马克斯克鲁维酵母能发酵蔗糖、乳糖分解的葡萄糖产生大量CO2有关［19］。

图6　发酵过程中理化指标的测定结果Fig.6 Changes in physical and chemical indexes during fermentation

由图6可知，Y51-6在发酵初期0～12 h内处于延滞期。12～24 h为对数期，在此阶段Y51-6生长速率快，活菌数由3.6×105CFU/mL迅速增长到3.5×106CFU/mL。24～32 h为稳定期，此时活菌数基本保持不变。当发酵达到32 h，Y51-6生长开始进入衰亡期，在发酵40 h时，活菌数下降到4.0×105CFU/mL。

发酵过程中稀奶油的pH值逐渐降低，酸度不断升高，pH值与酸度整体呈负相关。发酵达到40 h时，pH值由最初的6.40下降到5.65，酸度由8.57 °T上升至33.0 °T，这可能与代谢产生有机酸和CO2有关。马克斯克鲁维酵母可以利用碳水化合物进行代谢，从而导致发酵过程中酒精体积分数的不断升高。稀奶油的酒精体积分数随发酵时间延长不断升高，当发酵达到40 h时，酒精体积分数达到2.4%。

2.3SPME-GC-MS分析

SPME能有效地吸附样品中的挥发性组分，经过数据库检索比对，发酵前后稀奶油的挥发性风味组分的SPME-GC-MS分析总离子流图如图7所示，主要挥发性组分分析结果见表3。

图7　经Y51-6发酵前后稀奶油样品挥发性风味物质总离子流图Fig.7 Total ion chromatograms of volatile flavor components of cream and cream fermented by Kluyveromyces marxianus Y51-6

表3　SPME前处理方法结合GC-MS分析稀奶油发酵前后挥发性风味物质Table 3 Volatile composition of cream before and after fermentation identified by SPME combined with GC-MS

续表3

发酵前后的稀奶油样品中共检出45种主要挥发性风味组分，并且发酵前后的挥发性风味组分有较大差别。稀奶油中风味物质种类较少，特征风味组分明显，主要是序号为1、8、19、36的峰，这些峰对应的主要是酮类物质。发酵后的稀奶油，酮类物质比例下降，其余种类挥发性化合物明显增多，主要检测出醇类、酯类、烷烃类化合物等。

2.3.1发酵前稀奶油的风味特征

经过SPME富集，GC-MS分离与检测，未经发酵的稀奶油样品中共检测出17 种主要成分，其中主要包括2-庚酮、2-壬酮、2-十一烷酮在内的甲基酮类化合物，这与王蓓［6］、李良［20］等的研究结果相似。甲基酮类物质占整个挥发性风味组分含量的63.54%。其中奶油的特征风味为2-庚酮［21-22］，具有类似梨的水果香味，含量更是高达49.84%；2-壬酮具有果香及椰子、奶油的气味；2-十一酮具有花香味。甲基酮类化合物的阈值较低，一般是μg/mL级，大多数带有令人愉悦的水果及奶油味，是天然奶香的主要贡献成分。除此之外，还检测出γ-二甲基丁内酯、δ-壬内酯等内酯类物质，内酯类物质的产生是可能是脂类热氧化的结果［23］。

2.3.2发酵后稀奶油的风味特征

经过Y51-6发酵的稀奶油样品中共检测出35 种主要成分，除保留了2-庚酮、2-壬酮、2-十一烷酮类物质外，挥发性风味成分得到了极大的丰富。甲基酮类物质组成比例下降明显，但是新检测出了2-十九烷酮。

经发酵后的稀奶油样品，其酯类物质明显增多，新检测出的酯类物质主要包括己酸乙酯、辛酸乙酯、2-苯乙醇乙酸酯，酵母菌具有酯化作用［24-25］，酯类物质来自醇类之间的反应、乳糖代谢或氨基酸分解代谢以及脂肪酸和氨基酸分解产物的中间体，大部分具有花香、果香味［26］。其中己酸乙酯天然存在于菠萝、草莓等水果中，具有强烈的果香和酒香香气；辛酸乙酯具有白兰地酒香味，主要用于调味品以及香料制造［27］；2-苯乙醇乙酸酯具有玫瑰花香，带有甜蜜的蜂蜜香气，类似苹果果香，并带有可可和威士忌的香韵。

经发酵后的稀奶油样品，产生了一些醇类物质，主要是苯乙醇，其含量高达8.27%，天然存在于玫瑰油等芳香油中，被广泛应用于各种食用香精和烟用香精中，是配制玫瑰香型食用添加剂。

发酵后的奶油样品中还检测出了长叶烯。长叶烯是一种天然香料，一般是从重级松节油提取出来，用于香精调配时可以代替某些价格昂贵的香料。月桂醛，即十二醛，天然存在与苹果、甜橙、柑橘等水果中，具有皂香、蜡香、醛香、柑橘香、紫罗兰花香，可用于调配奶油、香蕉、橙子等食用香精。（Z）-香叶基丙酮具有果香、木香，用于调配苹果、香蕉、热带水果等食用香精。

发酵前后的稀奶油中均检测出了饱和烷烃类物质。发酵后检测出多种烷烃类物质，包括十三烷、十五烷、十九烷、十六烷，但由于饱和烷烃类物质阈值较高、香气无特色、不典型，故而烷烃类化合物虽然占挥发性化合物比例较大，但并非主要风味物质。

3　结 论

本实验以感官评分、酒精体积分数作为指标，对稀奶油的发酵工艺进行优化。经过单因素试验结合正交试验确定最佳发酵工艺条件为：发酵时间40 h，发酵温度45 ℃，蔗糖添加量7 g/100 mL，接种量7%。并对发酵过程进行动态追踪，马克斯克鲁维酵母Y51-6在发酵12 h内处于延滞期，12～24 h为对数期，24～32 h为稳定期，32 h之后酵母生长进入衰亡期。发酵过程中pH值逐渐降低，酸度则不断升高，酒精体积分数逐渐增加，色值变化不明显。

研究发酵前后稀奶油的挥发性风味物质，分析结果表明：未经发酵的稀奶油共检测出17 种主要成分，主要成分为2-庚酮、2-壬酮、2-十一酮等甲基酮类化合物。而经过马克斯克鲁维酵母Y51-6发酵的稀奶油样品成分复杂，共检测出35 种主要成分，除保留了甲基酮类化合物，酯类物质、醇类物质明显增多，此外，还检测出长叶烯和月桂醛等物质。可见经过该工艺发酵的稀奶油挥发性风味成分得到了极大的丰富，醇类、酯类物质赋予了产品更加清香、令人愉悦的气味，与感官评价结果相符合，可以作为食品增香剂用于食品加工业。

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Optimization of Fermentation Parameters for Dilute Cream by Kluyveromyces marxianus Y51-6 and Its Volatile Flavor Components Analyzed by SPME-GC-MS

WANG Dan， LI Wei， RUI Xin， MA Yuxiao， XU Xiao， HUANG Lu， WU Han， DONG Mingsheng*
（College of Food Science and Technology， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， China）

The purpose of this work was to define optimal conditions for the fermentation of dilute cream by Kluyveromyces marxianus Y51-6. Optimization of fermentation conditions for improved alcohol content and sensory evaluation was carried out using an orthogonal array design. A fermentation temperature of 45 ℃， addition of sucrose at 7 g/100 mL， an inoculum size of 7% （V/V） and 40 h fermentation proved optimal. The fermentation process involved lag phase （0-12 h）， logarithmic phase （12-24 h）， stable phase （24-32 h） and declining phase （after 32 h）. The pH decreased during the fermentation process，while acidity and alcohol content increased gradually and color parameters did not change significantly. The results of analysis by solid-phase micro-extraction （SPME） and gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS） showed that 17 components were detected in unfermented cream， which were dominated by methyl ketones such as 2-heptanone and 2-nonanone. Totally 35 components were detected in fermented cream samples， among which the proportion of methyl ketones was reduced， while esters and alcohols such as phenylethyl alcohol and ethyl caproate revealed a significant increase.

Kluyveromyces marxianus； dilute cream； process optimization； solid phase micro-extraction combined with gas chromatography-mass spectrometry

TS252.54

A

1002-6630（2015）15-0112-06

10.7506/spkx1002-6630-201515021

2014-09-22

“十二五”国家科技支撑计划项目（2013BAD18B01-4）；国家高技术研究发展计划（863计划）项目（2011AA100903）；国家自然科学基金青年科学基金项目（31201422）；国家自然科学基金面上项目（31371807）；江苏高校优势学科建设工程资助项目（PAPD）

王丹（1990—），女，硕士，研究方向为食品微生物。E-mail：wander04@163.com

董明盛（1961—），男，教授，博士，研究方向为食品微生物与生物技术。E-mail：dongms@njau.edu.cn