臭氧降解玉米中黄曲霉毒素B1效果及降解动力学研究

罗小虎，王 韧，王 莉，李永富，李亚男，周蕴宇，朱丽君，陈正行*

（江南大学食品学院，食品科学与技术国家重点实验室，粮食发酵工艺与技术国家工程实验室，江苏 无锡 214122）

臭氧降解玉米中黄曲霉毒素B1效果及降解动力学研究

罗小虎，王 韧，王 莉，李永富，李亚男，周蕴宇，朱丽君，陈正行*

（江南大学食品学院，食品科学与技术国家重点实验室，粮食发酵工艺与技术国家工程实验室，江苏 无锡 214122）

玉米是我国重要的食品和饲料原料，当收获、加工和储藏等措施不当时，可能会造成黄曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）污染玉米这一突出问题，AFB1已被国际癌症机构定为1级致癌物。尽管目前已建立了一些物理、化学和生物降解AFB1的方法，但高效、安全、经济的绿色降解方法仍很少。本研究以AFB1污染的玉米为试样，研究臭氧对玉米中AFB1的降解效果。结果表明：AFB1降解率随着臭氧质量浓度的增加和处理时间的延长而显著提高；当水分质量分数为20.37%的玉米经90 mg/L的臭氧处理40 min后，AFB1含量由77.6 μg/kg降低到21.42 μg/kg，降解率达72.4%。臭氧降解AFB1的动力学模拟结果表明，臭氧降解AFB1符合一级动力学模型。玉米中AFB1降解速率常数按以下次序递减：k90mg/L＞k65mg/L＞k40mg/L。实验得到臭氧降解AFB1的动力学方程、反应速率常数、决定系数和半衰期，为最优地控制臭氧降解AFB1的反应条件奠定了理论和实践基础，也为臭氧降解AFB1污染玉米的应用提供了技术保障。

黄曲霉毒素B1；玉米；臭氧；降解；动力学

黄曲霉毒素（aflatoxins，AFs）主要是由黄曲霉（Aspergillus flavus）和寄生曲霉（Aspergillus par asiticus）产生的一类具有严重致癌、致畸和致突变的化学结构类似的次级代谢产物的总称。在已发现的20余种AFs中，又以黄曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）最常见且毒性最强。玉米是我国最重要的食品原料之一，在整个国民经济发展中占有非常重要的地位，玉米不仅可作为食品原料，还经常用来做小吃、酒精饮料和动物饲料，长期摄入AFB1污染的玉米及其制品，即使量非常低，也会对人和动物造成严重的伤害。为此，我国非常重视控制玉米及其制品中AFB1含量，以减少对人和动物的危害［1］。然而，尽管不断改进玉米的加工、干燥和储藏措施，但目前AFB1的危害依然极其严重［2］。因此，除采取行之有效的措施防止AFB1污染玉 米之外，对已污染的玉米进行安全有效的脱毒处理，对保证玉米安全性和减少经济损失具有重要意义。

尽管目前已建立了一些物理、化学和生物降解AFB1方法，但高效、安全的降解方法仍很少［3-4］。早在1997年，美国食品药品监督管理局就将臭氧作为一种普遍认为安全的方法应用于食品加工过程中，目前臭氧已在食品加工贮藏、果蔬保鲜、废水处理等领域得到广泛应用［5-7］。而自20世纪60年代AFs被发现以来，Dollear［8］和Dwarakan［9］等就较早利用臭氧降解花生粕和棉籽粕中AFs。此后，大量研究人员不断研究臭氧对各种原料如玉米［10］、开心果［11］、红辣椒［12］、花生［13］和无花果［14］中AFs的降解效果，结果均表明臭氧对AFs具有良好降解效果。国内外利用臭氧降解真菌毒素的研究主要集中在降解AFs上，特别是AFB1的降解［15-18］。这主要是由于臭氧容易通过亲电作用破坏AFs终端呋喃环上的C8-C9键，且AFs一旦形成臭氧化产物后，再通过分子重排形成臭氧化衍生物如醛类、酮类和有机酸［19-20］。臭氧除能有效降解各类食品中AFs外，还有良好的消毒、脱色性能［21-22］，杀灭食品贮藏过程中的各种有害微生物和害虫，如细菌、真菌、霉菌、病毒等［23-24］。因此，用臭氧降解食品中AFB1具有良好的应用潜力。

本研究采用不同臭氧条件处理AFB1污染的玉米，以AFB1的降解率作为衡量臭氧处理效果的指标。通过研究臭氧处理对玉米中AFB1的降解效果及降解规律，判定臭氧反应速率的关键控制点，建立相应的降解动力学模型，优化臭氧降解参数，为AFB1污染玉米臭氧降解方法的应用提供理论和实践指导。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

AFB1标品（纯度≥98.0%） 瑞士Alexis公司；AFs污染的玉米 湖南岳阳市售；MycoSep 226#型固相萃取柱 美国Romer Labs公司；甲醇、乙腈（色谱纯）美国Fisher Scientifi c公司；三氟乙酸、正己烷（分析纯）国药集团（上海）化学试剂有限公司。

1.2仪器与设备

1260型高效液相色谱仪（带有荧光检测器、ZORBAX SB-C18柱） 美国Agilent公司；Simplicity UV超纯水制备系统 法国Millipore公司；QJ-8003K-A臭氧发生器 青岛国林实业股份有限公司；超声波清洗仪昆山市超声仪器有限公司；IDEAL-2000臭氧气体浓度在线检测仪 山东淄博爱迪尔测控技术有限公司。

1.3方法

1.3.1AFB1标准溶液制备

准确称量5.0 mg的AFB1标品，溶于色谱纯甲醇中，配成质量浓度为100 mg/L的AFB1标准储备液后，－18 ℃保存。将100 mg/L的标准储备液用甲醇稀释成20 mg/L的AFB1标准工作液，4 ℃保存，待用。

1.3.2臭氧降解AFB1

臭氧发生器的氧气源由外接纯氧气提供，臭氧质量浓度通过调整电压和氧气流量调节，臭氧气体流速通过流量计调节。

将100 g玉米放入1 L玻璃反应器，臭氧气体经玻璃导管通至反应器底部，多余臭氧从顶部排出。为了让原料和臭氧充分接触，不断将臭氧通入反应器中，并每2.5 min将原料充分搅拌混匀一次。原料与臭氧的反应在环境温度为25 ℃，相对湿度为75%，臭氧质量浓度为0～90 mg/L，处理时间为0～40 min条件下完成。臭氧处理完原料后，静置120 min后再裹入干净的聚乙烯袋中，密封，4 ℃保存，待用。

1.3.3玉米中AFB1含量的测定

玉米中AFB1含量的测定方法根据GB/T 5009.23-2006《食品中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的测定》做适当调整。玉米样品粉碎后过0.85 mm孔径筛，取30 g样品放入250 mL烧瓶，加3 g NaCl和100 mL乙腈-水（80∶20，V/V），150 r/min振荡30 min，取上清液过滤，5 mL滤液过固相萃取柱，收集3 mL净化液入棕色小瓶，60 ℃ N2吹干，200 μL正己烷和100 μL三氟乙酸溶解样品，立即盖紧小瓶并涡旋15 s，40 ℃衍生化30 min，60 ℃ N2吹干，残渣用200 μL水-乙腈（85∶15，V/V）重新溶解，涡旋混合15 s，10 000 r/min离心5 min，取上清液放入小瓶，4 ℃保存。

液相色谱检测条件：安捷伦1260液相系统，配自动进样器，四元泵系统和荧光检测器；荧光检测器激发（λex）和发射（λem）波长分别为360、440 nm；液相色谱柱：ZORBAX SB-C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：水-甲醇（65∶35，V/V）；进样体积：10 μL；流动相流速：1.0 mL/min；色谱柱柱温：30 ℃。

1.4数据统计分析

2　结果与分析

2.1臭氧降解玉米中AFB1效果

图1　臭氧处理对玉米中AAFFBB1降解效果Fig.1 Effect of ozone on degradation of AFB1in corn

如图1所示，在臭氧处理前，水分含量为20.37%的玉米中AFB1含量分别为77.6 μg/kg，超过GB 13078-2001《饲料卫生标准》对饲用玉米中AFB150 μg/kg的限量要求。同时，图1中显示了不同臭氧质量浓度和处理时间对玉米中AFB1的降解效果，从图1中看出，提高臭氧质量浓度和延长处理时间，AFB1的降解率都显著升高（P＜0.05）。这个结果与Akbas［11］、Inan［12］和de Alencar［13］等的研究结果是一致的，即随着臭氧质量浓度的增加和处理时间的延长，红辣椒、花生和开心果中AFB1降解率显著提高。而Proctor等［25］发现臭氧浓度一定，处理时间和温度不同条件下花生中AFB1的降解率达77%。上述结果均表明，臭氧对不同原料中AFB1都有良好的降解效果。另外，从玉米中AFB1的降解效果看，90 mg/L臭氧处理水分含量为20.37%的玉米40 min，AFB1的含量从77.6 μg/kg降低到21.42 μg/kg，降解率达72.4%，AFB1含量远低于中国饲用玉米限量标准（50 μg/kg）。

2.2臭氧对玉米中不同初始含量AFB1降解效果

图2 臭氧处理对玉米中不同初始含量AAFFBB1的降解效果Fig.2 Effect of ozone on degradation of AFB1at different initial contents in corn

图2为90 mg/L的臭氧对玉米中不同初始含量的AFB1降解过程的影响。图2中3 条不同初始含量AFB1的降解曲线趋于一致，说明当AFB1初始含量分别为77.6、38.8、19.4 μg/kg时，90 mg/L的臭氧处理对玉米中AFB1降解率差异影响较小。由此可知，在本实验选择的AFB1含量范围内，AFB1初始含量对臭氧降解AFB1效果无显著影响。

2.3臭氧降解AFB1的反应动力学模型

臭氧降解AFB1的化学反应动力学主要是研究臭氧降解AFB1的反应速率及其所遵循的规律，以及各因素对反应速率的影响，从而给接下来的研究提供反应的条件；探讨能够解释臭氧反应速率规律的可能机理，为最优地控制臭氧降解AFB1反应提供理论依据，找出决定臭氧反应速率的关键，使臭氧降解AFB1的反应能按照所需要的方向进行，并得到研究所希望的结果。

从一定程度上来说，臭氧降解AFB1的化学反应动力学研究比单纯的优化降解条件更重要，这是因为它不仅讨论化学反应的可能性，而且研究需要多长的时间才能达到预期的目标，即如何使可能性变为现实。但是，臭氧降解AFB1的化学反应动力学理论研究还不完善，本实验将对这一研究做一个初步探讨。在此，研究假设臭氧与AFB1反应符合一级反应，设反应为A→P，则其速率方程为：

将上面表达式用定积分形式表示，得到：

因为kA为常数，进行不定积分后可得：

即：

式中：c（A，0）为t=0时反应物A的初始浓度；c（A，t）为反应进行到t时刻反应物A的浓度；t为反应时间；kA为反应平衡常数。

式（3）、（4）为一级反应的动力学方程，该方程也可替换成指数形式，即：

由式（5）可以看出，反应物的浓度随时间延长呈现指数减小，只有当t=∞时，才有c（A，t）=0。该一级动力学方程具有如下特征：

由式（3）可以看出，ln c（A，t）对t作图为一直线，该直线斜率为－kA，截距为ln c（A，0）。

式中：kA为反应速率常数，其量纲是t－1，单位为s－1（或min－1、h－1等）。

由式（4）可得，当c（A，t）=c（A，0）/2时，即反应物A消耗一半所需要的时间（称为反应物A的半衰期）t（1/2，A）= ln2/kA=0.693 1/kA，与反应物A的初始浓度无关。

图3　玉米中AAFFBB1臭氧降解动力学曲线Fig.3 Kinetic curves of AFB1degradation in corn by ozone

图4　玉米中不同AAFFBB1含量的臭氧降解动力学曲线Fig.4 Kinetic curves of degradation of AFB1at different initial contents in corn by ozone

由图3、4可知，各质量浓度臭氧降解AFB1的动力学方程曲线拟合良好，符合一级动力学反应具有的3 项特征（图3），而臭氧降解不同初始含量AFB1的动力学反应也属于一级动力学反应（图4）。

2.4不同条件下AFB1的降解动力学参数

表1　臭氧降解玉米中AAFFBB1动力学参数Table 1 Kinetic parameters for degradation of AFB1in corn by ozonee

表2　臭氧降解不同初始含量AAFFBB1动力学参数Table 2 Kinetic parameters for degradation of AFB1at different initiall contents by ozoonnee

表1、2列出了不同条件下AFB1降解的动力学方程、决定系数、反应速率、半衰期和显著性分析结果。结果显示，动力学方程拟合效果较好（除臭氧质量浓度为40 mg/L以外，R2均大于0.98）。表1中为不同质量浓度臭氧降解玉米中AFB1的动力学参数，其中反应速率常数（kA）按以下次序递减：k90mg/L＞k65mg/L＞k40mg/L。从反应速率常数可看出，随着臭氧质量浓度升高，AFB1降解速率加快；而从降解效果来看，随着臭氧处理时间的延长，AFB1含量降低，这也与前人的研究结果是一致的［15，26］。表2中结果显示臭氧对不同初始含量AFB1的降解速率参数（kA）和半衰期（t1/2）没有显著影响，说明臭氧对AFB1的降解符合一级动力学反应。上述动力学模型在改变一些臭氧处理AFB1污染的玉米条件下，仍能较好地帮助评估臭氧处理后玉米中AFB1的含量。

3　结 论

通过臭氧对玉米中AFB1降解的实验，研究了臭氧质量浓度、处理时间等因素对AFB1降解效果的影响。质量浓度为90 mg/L的臭氧处理水分质量分数为20.37%的玉米40 min后，AFB1含量由77.6 μg/kg降低到21.42 μg/kg，降解率为72.4%。上述研究结果进一步验证了臭氧能快速有效地降解玉米中AFB1，且随着臭氧质量浓度的增加和处理时间的延长，AFB1的降解率显著升高（P＜0.05）。

臭氧降解AFB1化学反应动力学模型结果表明，玉米中AFB1降解速率以如下顺序递减：k90mg/L＞k65mg/L＞k40mg/L。通过对臭氧降解AFB1的动力学模拟，发现臭氧降解AFB1行为符合一级动力学模型。实验得到不同降解条件下臭氧降解AFB1的动力学方程、决定系数、反应速率常数、半衰期和显著性分析结果，为最优地控制臭氧降解AFB1反应条件及臭氧降解AFB1对玉米品质改变及安全性评价提供理论基础和实践依据，也为接下来臭氧降解AFB1污染玉米技术的可行性奠定了基础。

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Efficiency and Kinetics of Ozone Degradation of Aflatoxin B1in Corn

LUO Xiaohu， WANG Ren， WANG Li， LI Yongfu， LI Yanan， ZHOU Yunyu， ZHU Lijun， CHEN Zhengxing*
（National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology， State Key Laboratory of Food Science and Technology，School of Food Science and Technology， Jiangnan University， Wuxi 214122， China）

As an important ingredient in feed and food， corn is prone to being contaminated by AFB1during harvesting，processing and storage. Although several physical， chemical and biological protocols have been established to degrade AFB1， effi cient， safe， economical and environmentally friendly methods remain scarce. In this study， the effi ciency of ozone degradation of AFB1in corn was explored. The results showed that with increasing ozone concentration and treatment time， the degradation rates of AFs in corn were evidently elevated. The AFB1contents in corn with a moisture content of 20.37% plummeted from 77.6 μg/kg to 21.42 μg/kg after 40 min of treatment with 90 mg/L ozone， viz.， the degradation rate was 72.4%. The degradation of AFs in different raw materials by ozone followed fi rst order kinetics. The degradation rate constants of AFB1in corn followed the descending order of k90mg/L＞ k65mg/L＞ k40mg/L. Kinetics parameters， such as kinetic equations， reaction rate constants， correlation coeffi cients and half-life periods， provided valuable evidence for controlling ozonation under optimum conditions and for clarifying the infl uence of ozonation on AFB1in corn. Hence， the fi ndings allow feasible application of ozonation in degrading AFB1in corn.

afl atoxin B1； corn； ozone； degradation； kinetics

TS201.6

A

1002-6630（2015）15-0045-05

10.7506/spkx1002-6630-201515010

2014-10-05

公益性行业（粮食）科研专项（201313005）；中央高校基本科研业务费专项资金项目（JUSRP11510）；公益性行业（农业）科研专项（201203037）；国家自然科学基金面上项目（31371874）；“十二五”国家科技支撑计划项目（2012BAD34B02）

罗小虎（1983—），男，副教授，博士，研究方向为粮食质量与安全。E-mail：xh06326@gmail.com

陈正行（1960—），男，教授，博士，研究方向为粮食精深加工及安全。E-mail：zxchen_2008@126.com