参附注射液对脓毒症大鼠心肌细胞凋亡及Bcl-2表达的影响*

胡丹丹　楼黎明　徐慧连

（浙江中医药大学附属第三医院，浙江杭州310005）

·研究报告·

参附注射液对脓毒症大鼠心肌细胞凋亡及Bcl-2表达的影响*

胡丹丹楼黎明徐慧连△

（浙江中医药大学附属第三医院，浙江杭州310005）

目的观察参附注射对脓毒症大鼠心肌细胞凋亡及Bcl-2蛋白表达的影响，探讨参附注射液抗脓毒症心肌损伤的相关机制。方法将24只雄性SD大鼠随机分为3组：假手术组、模型组和参附组，以盲肠结扎穿孔（CLP）法建立脓毒症大鼠动物模型，观察各组大鼠心肌酶谱变化；凋亡原位末端标记法（TUNEL）检测心肌细胞凋亡指数，以RT-PCR法检测心肌细胞Bcl-2 mRNA表达。结果参附组大鼠心肌酶谱升高程度较模型组低（P＜0.05），模型组较假手术组心肌酶水平高（P＜0.05）；参附组大鼠心肌细胞TUNEL评分平均光密度（MOD）较模型组明显降低（P＜0.05），模型组较假手术组升高（P＜0.05）；模型组心肌细胞Bcl-2 mRNA表达较假手术组明显降低（P＜0.05），参附组较模型组升高（P＜0.05）。结论参附注射液能减轻脓毒症大鼠的心肌损伤，其作用机制与上调Bcl-2 mRNA表达、减少心肌细胞凋亡相关。

参附注射液脓毒症细胞凋亡Bcl-2

脓毒症是感染性疾病和创伤性疾病应激过程中常见的并发症，具有发病率、死亡率高的临床特点，其高死亡率与其易导致多脏器功能损伤有直接关系，而其中有40%～50%的脓毒症为导致心功能不全，其病理表现为心室扩张、收缩及舒张功能障碍［1］。心脏实质细胞的损伤是心功能不全发生的主要原因。细胞凋亡在脓毒症的发生、发展中起着重要作用，已有的试验已证明抗凋亡治疗有逆转脓毒症心肌损伤的作用［2］。而在中医学脓毒症认识中，心功能不全多责之于邪气损伤心阳、心阳不足。参附注射液具有温阳祛邪的作用，尤其多用于症见心阳不足的患者，而对其抗脓毒症心肌损伤的机制探讨较少。因此本研究通过观察参附注射液对大鼠脓毒症模型心肌损伤标记物、心肌细胞凋亡指数及Bcl-2 mRNA表达的影响，探讨参附注射液对脓毒症大鼠心脏实质细胞损伤的保护作用。现报告如下。

1　材料与方法

1.1动物雄性清洁级SD大鼠，24只，体质量（200± 20）g，购自上海斯莱克实验动物有限公司。造模前于实验动物中心，适应性喂养7 d。

1.2药物与试剂参附注射液（雅安三九药业有限公司生产，批号：国药准字Z20043117）。戊巴比妥钠。氯仿，异丙醇，二硫代苏糖醇，RNasin，dNTP，随机引物，DNaseI，逆转录酶，SYBR I，50×Calibration，HS ExTaq酶及10×Buffer等；TNF-α ELISA试剂盒（烟台赛尔斯公司）；LightShift化学发光EMSA试剂盒（Pierce，美国）等。低温离心机；紫外分光光度计；电泳转膜装置；数显恒温水浴锅；Model 550酶标仪；BioSenSC300凝胶图像分析系统；PTC-225 Peltier Thermal Cycler；Rotor-Gene RG-3000 Real-Time Thermal Cycler等。

1.3分组与造模按体质量随机将24只SD大鼠分为假手术组、模型组和参附组，每组8只动物。脓毒症模型制备方法参照文献报道以盲肠结扎穿孔（CLP）法制备脓毒症模型［3］。模型组大鼠行CLP术后，分别于0、6、12 h尾静脉注射0.9%氯化钠注射液5 mL/kg，参附组分别于CLP术后0、6、12 h行尾静脉注射参附注射液5 mL/kg。

1.4标本采集与检测各组于CLP术后24 h分别麻醉并腹主动脉采血处死，留取心肌组织行相关指标检测；假手术组麻醉后开腹翻动肠道，关腹，24 h后麻醉，腹主动脉采血处死，留取心肌组织行相关检测。应用自动生化分析仪检测心肌损伤标志物，指标包括心肌肌酸激酶（CK）和心肌肌酸激酶同工酶（CK-MB）。TUNEL法检测肺组织细胞凋亡取心肌组织，制备石蜡切片。具体方法依照试剂盒说明书。荧光定量PCR法检测心肌Bcl-2 mRNA水平，总RNA提取方法如下：1）约100 mg组织于冰浴匀浆器中，冰上迅速研磨成匀浆液，加入1 mL Trizol，剧烈震荡，室温放置5 min。2）加入0.2 mL的氯仿，盖好后漩涡剧烈震荡15 s，室温放置2～3 min，然后离心12000 r/min，15 min，4℃。离心后分成3层，下面的红色为酚-氯仿相，1个中间层，一面是无色的水相。RNA只存在于水相中。3）将上层水相转移到另一干净的EP管中，加入等体积的异丙醇，静置30 min，-20℃，然后离心12000 r/min，15 min，4℃。4）去上清液，加入1 mL 75%乙醇洗涤RNA沉淀，振荡器混匀，离心7500×g，5 min，4℃。5）去上清，置真空或空气中5～10 min，干燥RNA沉淀。根据沉淀的量加入适量的RNase free水溶解RNA，去除基因组DNA；RNA定量后逆转录为cDNA；引物序列为Bcl-2（110bp），F：5′-AGTACCTGAACCGGC ATCTG-3。R：5′-CAGCCAGGAGAAATCAACAG-3′。GAPDH（130bp），F：5′-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3。R：5′-GGCATG GACTGTGGTCATGAG-3′。以总cDNA为模板进行实时定量PCR，应用相对定量方法分析各样本的ΔCt值（ΔCt=母的基因Ct值-内参基因Ct值），再依据ΔΔCt值=实验组ΔCt值-对照组ΔCt值计算2-ΔΔCt的值。当目的基因与内参基因的扩增效率接近时，2-ΔΔCt的值表示目的基因在实验组样本中相对于对照组样本的表达倍数。

1.5统计学处理应用SPSS 18.0统计软件处理。各项计量资料以（±s）表示。采用单因素方差分析；方差齐性选用LSD检验，方差不齐采用Dunnett’s T3法检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1各组大鼠心肌酶谱水平比较见表1。与假手术组比较，模型组、参附组大鼠血清CK-MB、CK较假手术组明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，参附组大鼠血清CK-MB、CK较模型组明显降低（P＜0.05）。

表1　各组大鼠心肌酶水平比较（U/L，±s）

表1　各组大鼠心肌酶水平比较（U/L，±s）

与假手术组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05。下同。

组别nCK-MBCK假手术组82187.41±556.631189.40±245.87模型组84208.51±382.57*3216.75±565.42*参附组83584.59±347.06*△1986.21±366.73*△

2.2各组大鼠心肌细胞凋亡比较见表2和图1。各组均可见凋亡细胞，模型组、参附组大鼠心肌细胞TUNEL评分平均光密度（MOD）均高于假手术组（P＜0.05）；参附组MOD较模型组明显降低（P＜0.05）。

表2　各组大鼠心肌细胞MOD及Bcl-2 mRNA表达比较（±s）

表2　各组大鼠心肌细胞MOD及Bcl-2 mRNA表达比较（±s）

组别n假手术组8模型组8参附组8 MOD（U/L）Bcl-2 mRNA（10-3）0.09±0.055.75±0.09 0.24±0.11*3.83±0.07*0.18±0.09*△4.86±0.08*△

图1　各组大鼠心肌细胞凋亡情况（20倍）

2.3各组大鼠心肌组织Bcl-2 mRNA表达水平变化见表2。模型组、参附组大鼠心肌Bcl-2 mRNA均较假手术组明显降低（P＜0.05）；参附组大鼠心肌Bcl-2 mRNA与模型组明显升高（P＜0.05）。

3　讨论

脓毒症可使多个器官同时受损，而心脏是其损伤最为重要的靶器官。心肌酶属胞浆酶，组织损伤时由于细胞膜的完整性破坏而释放出来，血清CK、CK-MB是最常用的心肌损害指标。CK-MB绝大部分存在于心肌细胞内，是心肌细胞特异性酶，能够及时反映心肌损害的程度；CK主要分布在骨骼肌、心肌和脑组织。本实验结果显示，模型组和治疗组两种酶均有不同程度的升高，与假手术组比较有显著差异，表明CLP动物存在心肌的病理损伤。治疗组与模型组比较，两种酶均有所降低，表明参附注射液对脓毒症心肌损伤有一定的保护作用。

研究发现脓毒症心肌损伤除与心肌细胞低氧、线粒体损伤能量代谢障碍有关，还与心肌细胞凋亡有关［1］。脓毒症心肌细胞的凋亡过程涉及多条信号转导通路，其中线粒体途径是最重要的通路之一［4］。Bcl-2是此途径中的关键调节因子，有抑制凋亡作用。Bcl-2表达占优势时可阻止细胞凋亡［5］。在小鼠CLP模型，抗凋亡蛋白Bcl-2的过表达可抑制巨噬细胞和树突状细胞的细胞凋亡［6］，肠道特异Bcl-2过表达的转基因小鼠脓毒症死亡率较其他小鼠低［7］。陈华文等［8］研究亦发现，脓毒症大鼠心肌细胞Bcl-2蛋白表达下降，心肌细胞凋亡增加。本研究显示，模型组及参附组大鼠心肌Bcl-2 mRNA表达均高于假手术组，心肌细胞凋亡增加，均有统计学差异。

中医学认为正气不足是脓毒症发生之根本。“正气存内，邪不可干”“邪之所凑，其气必虚”，从根本上阐明了疾病发生发展的内在“正虚”因素，也为扶正祛邪防治脓毒症及脓毒症器官损伤提供了理论依据。《内经》有“少火生气，壮火食气”的论述，脓毒症邪气伤人，先伤脏腑之功能，后则损及形质，重症脓毒症的高热阶段必然耗损正气，甚则阳气耗散，脓毒症心脏损伤，也表现为先伤及心阳而后心之形质受损。“阳化气、阴成形”，脓毒症时邪气损伤心阳，心阳受损、气化失司，阴血不生，脏腑失养而进一步加剧心脏功能障碍。因此温阳益气是治疗脓毒症心脏损伤的关键，通过温心阳，心阳恢复、气化得行则阴血自生，从而恢复正常的脏腑功能。

脓毒症心肌损伤，为邪气盛实，心阳虚衰。参附注射液由红参、附子组成，主要有效成分为人参皂苷和乌头碱，具有温阳益气养心、回阳救逆之效。临床常用于脓毒症而症见胸闷、气促、悸动不安、动则尤甚等心阳不足证候者。参附注射液具有抗缺血再灌注损伤、改善心脏功能、抗休克、增强心肌收缩力等作用。江荣林等［9］研究表明，参附注射液能够显著改善脓毒症患者的组织缺氧。邱泽亮等［10］则发现参附注射液可以降低严重脓毒症患者急性生理和慢性健康状况评分（APACHE）Ⅱ、Marshall评分及白介素-6（IL-6）和C反应蛋白（CRP）水平，明显升高CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞和单核细胞HLA－DR，提示参附注射液能够调节促炎和抗炎的平衡，并双向调节脓毒症导致的免疫紊乱。本研究显示，与模型组比较，参附组大鼠心肌Bcl-2 mRNA表达较模型组上调，细胞凋亡明显减少，心肌损伤酶学指标较模型组降低。通过上述实验分析，可证明参附注射液可以通过上调心肌细胞Bcl-2 mRNA表达，减少脓毒症大鼠心肌细胞凋亡，改善脓毒症相关的心肌损伤。

脓毒症心肌损伤机制繁多，同时也存在其他治法及方剂使用的临床及实验报道，对于参附注射液逆转脓毒症心肌损伤的剂量疗效关系、其他作用机制及与其他治法方剂的比较仍需进一步实验证实。

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［8］陈华文，冯俊，李树生.丹参酮ⅡA对脓毒症大鼠心肌凋亡的保护作用［J］.中国药学杂志，2013，48（17）：1267-1271.

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［10］邱泽亮，叶一萍，张宁，等.参附注射液对严重脓毒症免疫调节的前瞻性研究［J］.中华中医药学刊，2012，31（2）：363-366.

Effect of Shenfu Injection on the Cardiomyocyte Apoptosis and the Expression of Bcl-2 in Rat with Sepsis

HU Dandan，LOU Liming，XU Huilian.The Third Affiliated Hospital of Traditional Chinese Medical University，Zhejiang，Hangzhou 310005，China

Objective：To investigate the anti-myocardial injury mechanism of Shengfu Injection by the change of myocardial enzyme and the expression of Bcl-2 and myocardial cell apoptosis in rat model with sepsis.Methods：24 male SD rats were randomly divided into three groups：the sham-operated group，the model group and the Shenfu group，8 rats in each.Rat sepsis models were established with CLP.The change of myocardial enzyme spectrum was observed.Myocardial apoptosis was detected with TUNEL，and the expression of Bcl-2 mRNA in myocardial cell was detected with RT-PCR.Results：The rise of myocardial enzyme spectrum in Shengfu Injection group was lower than that of the model group（P＜0.05）.Myocardial enzyme level of the model group was higher than that of the sham-operated group（P＜0.05）.TUNE L scores of cardiac muscle cells and MOD of Shengfu Injection group was lower than that of the model group（P＜0.05），and higher than that of the sham-operated group（P＜0.05）.The expression level of Bcl-2 mRNA in myocardial cell of model group was lower than the sham-operated group（P＜0.05），while the Shengfu Injection group was higher than the model grou（P＜0.05）. Conclusons：Shengfu Injection can alleviate injury in cardiac muscle caused by sepsis by upregulating the expression level of BCL-2 and reducing myocardial apoptosis.

Shengfu Injection；Sepsis；Apoptosis；Bcl-2

R285.5

A

1004-745X（2015）09-1540-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.09.013

2015-04-18）

浙江中医药大学科研项目（2010LX22）；浙江中医药大学附属第三医院一般项目（ZS10CA15）

（电子邮箱：xhl9366@163.com）