苦荞麦黄酮对心肌缺血再灌注大鼠心功能的影响*

潘嘉西　叶向阳　王永光　潘嘉林　林加锋△

（1.温州医科大学附属第三医院，浙江瑞安325200；2.温州医科大学附属第二医院，浙江温州325000）

·研究报告·

苦荞麦黄酮对心肌缺血再灌注大鼠心功能的影响*

潘嘉西1叶向阳1王永光1潘嘉林2林加锋2△

（1.温州医科大学附属第三医院，浙江瑞安325200；2.温州医科大学附属第二医院，浙江温州325000）

目的观察苦荞麦黄酮对缺血再灌注大鼠心肌的保护作用，并初步探讨其可能机制。方法SD大鼠随机分成假手术组、模型组、苦荞麦黄酮处理组，建立心肌缺血再灌注损伤模型，观察并记录缺血和再灌注状态下大鼠的血流动力学指标［左室收缩压（LVSP）、左室舒张末期压力（LVDEP）、左室内压上升最大速率（±dp/dtmax）、左室内压下降最大速率（-dp/dtmax）］的变化；测定血清中血清乳酸脱氢酶（LDH）、肌酸激酶（CK）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）、一氧化氮（NO）的含量；采用TTC法计算心肌梗死程度。结果与模型组相比，黄酮组的LVSP及±dp/dtmax的绝对值均显著升高，LVEDP值显著下降；黄酮组能有效降低心肌缺血再灌注大鼠血清中LDH、CK和MDA的含量，显著增加SOD、GSH-PX和NO的含量，减轻心肌梗死程度。结论苦荞麦黄酮对大鼠缺血再灌注心肌具有一定的保护作用，其机制可能与苦荞麦黄酮可以提高氧自由基清除能力，抑制氧自由基产生，降低脂质过氧化损伤，增强NO水平有关。

苦荞麦黄酮心肌缺血再灌注心功能

心肌缺血再灌注损伤（MIRI）是指心肌在缺血发生后，血流再次恢复灌注而引起的一系列心肌损伤，这是一个复杂的病理生理过程［1］。在心血管系统疾病中有着较高的发病率和死亡率［2-3］。缺血再灌注是造成临床心脏外科手术失败的重要原因之一，已成为心脏外科手术后亟待解决的问题［4］。

苦荞麦（Buckwheat）又名鞑靼荞、野荞麦、野南荞，属蓼科双子叶植物，喜阴凉，耐瘠薄，主要分布于我国高寒山区［5］。苦荞麦是一种重要的小宗杂粮作物和药食同源植物，有着悠久的入药历史，其性味苦、平、寒，具有益气力、续精神、解毒消肿、健胃行滞等作用，被称为“药食两用”的粮食珍品［6-7］。苦荞麦中含有其他禾谷类植物所没有的黄酮类物质，其含量高达3.25，主要为芦丁、槲皮素、山奈酚等［8］。黄酮类物质具有抗炎、抗氧化、清除氧自由基、改善血管微循环、对缺血损伤的保护作用等生理活性［9-10］。为进一步研究苦荞麦中黄酮的药理作用，本实验将观察苦荞麦中所含的黄酮类物质对大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响，为其临床应用提供实验依据。

1　材料与方法

1.1实验动物30只SD大鼠，清洁级，体质量200～250 g，由浙江省疾病预防控制中心购买，本实验研究获得动物伦理委员会和动物实验控制和监督委员会的同意。

1.2药物及试剂苦荞麦黄酮提取物：由西安斯诺特生物技术有限公司提供，使用前用生理盐水溶解为100 mg/L备用；血清乳酸脱氢酶（LDH）、肌酸激酶（CK）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）、一氧化氮（NO）试剂盒均购自南京建成生物工程有限公司。

1.3分组及给药将SD大鼠随机分为3组，每组10只，雌雄各半，苦荞麦黄酮组予苦荞麦黄酮提取物50 mg/（kg·d），假手术组和模型组给予相同体积的0.9%氯化钠注射液，各组均为灌胃给药，连续用药7 d。

1.4模型制备采用大鼠冠状动脉左前降支结扎法［11］制作心肌缺血再灌注模型。各组大鼠给药7 d后，于末次给药30 min后，腹腔注射3%戊巴比妥钠（30 mg/kg）进行麻醉，固定大鼠，四肢皮下插电极，监测Ⅱ导联心电图。分离双侧颈总动脉，由颈总动脉插管至左心室，连接微型动物呼吸机进行人工呼吸。于左侧胸骨第3、4肋间开胸，用手术线结扎冠状动脉左前降支，然后将心脏放回胸腔，挤出胸腔内气体，迅速关闭胸腔。结扎45 min后，解除结扎，心肌再灌注60 min。当心电图ST段明显上抬，结扎部位心肌颜色变暗，再灌注时，ST段回落1/2以上，心肌颜色变红表明心肌缺血再灌注造模成功。假手术组穿线不结扎。模型建立成功后，对相关指标进行检测。

1.5指标采集及检测1）心脏功能测定。采用BL-420S生物机能实验系统监测大鼠的心功能，分别记录结扎前（T0）、结扎后45 min（T1）、再灌注60 min（T2）后各项指标：左室收缩压（LVSP）、左室舒张末期压力（LVDEP）、左室内压上升最大速率（+dp/dtmax）、左心室内压最大下降速率（-dp/dtmax）。2）生化指标的检测。造模成功后，从颈总动脉取血2 mL于肝素化的离心管中，4℃3000 r/min离心10 min，取上清液，放于-80℃冰箱冷冻保存。按照试剂盒说明分别测定血清乳酸脱氢酶（LDH）、肌酸激酶（CK）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）、一氧化氮（NO）的含量。3）心肌梗死面积的测定。再灌注结束后，重新将冠状动脉左前降支结扎通过左心房注入2%伊文思蓝，非缺血区被染成蓝色，而缺血区心肌不被染色。将动物处死摘取心脏，预冷的0.9%氯化钠溶液清洗心脏，冲净余血，去除心房和右心室，放于-80℃冰箱速冻5 min。然后从心尖到心基部平行切为1～1.5 mm厚的薄片，将切片置于1%TTC磷酸盐缓冲液中（pH=7.4），37℃温育15 min，用冷水冲洗掉多余的染料，4%甲醛固定。非梗死区为蓝色，危险区为红色，梗死区为白色。显微镜下沿不同颜色边缘仔细分离各区域心肌，电子天平分别称量，以梗死区质量与危险区质量的比值（白色梗死区质量/危险区质量×100%）表示左心室梗死心肌范围。

1.6统计学处理应用SPSS17.0统计软件分析。计量资料以（±s）表示，采用单因素方差分析对多组间均数进行比较，组间比较采用t检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2　结果

2.1各组大鼠心脏功能测定比较见表1。各组大鼠的心功能指标在心肌缺血前差异无统计学意义。与假手术组相比，模型组和黄酮组在缺血末与再灌期间的LVSP及±dp/dt的绝对值均显著降低，LVEDP显著升高（P＜0.05）；与模型组相比，黄酮组的LVSP及±dp/dt的绝对值均显著升高，LVEDP值显著下降（P＜0.05）。

表1　各组大鼠心脏功能测定比较±s）

表1　各组大鼠心脏功能测定比较±s）

与假手术组同时期比较，**P＜0.01；与模型组同时期比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

LVSP（mmHg）LVDEP（mmHg）121.93±7.844.74±0.51 121.83±8.264.72±0.44 123.92±7.884.66±0.51模型组T0120.84±9.634.74±0.49（n=30）T1100.33±7.80**7.07±0.52**T273.32±10.41**11.77±0.76**黄酮组T0125.19±7.424.74±0.52（n=30）T1108.41±5.41**△6.13±0.29**△△T297.03±7.63**△△9.62±0.83**△△组别时间假手术组T0（n=30）T1 T2 +dp/dtmax（mmHg/s）5025.86±84.32 4995.11±86.13 4992.10±86.84 4990.69±77.12 4382.91±131.89**3537.19±149.90**4975.58±95.74 4628.82±164.20**△△4192.94±122.57**△-dp/dtmax（mmHg/s）-3564.71±116.28 -3554.41±118.22 -3500.53±111.33 -3496.45±96.51 -2982.82±111.87**-2265.41±159.90**-3509.39±102.51 -3193.61±130.75**△△-2619.75±72.19**△△

2.2各组大鼠血清生化指标比较见表2。与假手术组比较，模型组和黄酮组血清中LDH、CK和MDA的含量显著升高，SOD、GSH-PX和NO的含量显著下降（P＜0.01）；与模型组相比，黄酮组的LDH、CK和MDA的含量显著降低，SOD、GSH-PX和NO含量显著升高（P＜0.01）。

表2　各组大鼠血清生化指标比较±s）

表2　各组大鼠血清生化指标比较±s）

组别n LDH（U/L）CK（U/L）SOD（U/mL）MDA（μmol/L）GSH-PX（μmol/L）NO（μmol/L）假手术组30模型组30 849.89±120.941577.14±163.30150.84±26.11 1963.58±123.83**3489.18±258.36**78.89±12.61**4.36±0.94 8.58±1.21**1607.13±157.0547.98±10.80 1180.88±162.44**17.78±6.83**黄酮组301277.43±177.37**△△2660.33±137.94**△△113.07±19.81**△△6.08±1.34**△△1430.81±156.04**△29.03±5.72**△△

2.3各组大鼠心肌梗死范围比较见表3。经伊文思蓝染色后，假手术组心肌全部为蓝色，无梗死区；再由TTC染色后，模型组与黄酮组可以看到明显的白色梗死区，黄酮组较模型组梗死区范围明显缩小（P＜0.01）。

表3　各组大鼠心肌梗死范围比较（±s）

表3　各组大鼠心肌梗死范围比较（±s）

组别n梗死区/危险区（%）梗死区质量（g）危险区质量（g）假手术组300模型组3049.85±4.74 0 0 0.33±0.040.67±0.03黄酮组3035.06±6.18△△0.23±0.030.67±0.05

3　讨论

心肌缺血再灌注常发生于溶栓治疗、心脏移植等手术过程中，是临床上常见的难以克服的病理变化，其表现为心脏功能状态异常，恢复供血后心功能恢复与预期呈现显著差别，甚至心肌遭受进一步损伤。心肌缺血再灌注产生的原因比较复杂，可能与氧自由基的产生及其导致的脂质过氧化反应、一氧化氮、细胞内钙超载等作用有关，特别是氧自由基学说在其中占有重要地位［12］。因此，寻找可以有效清除氧自由基抑制脂质过氧化反应，恢复缺血区心肌细胞正常功能的药物已成为心肌缺血再灌注研究的重要方面。黄酮类物质具有抗氧化清除氧自由基，抑制炎症反应，对心血管的保护等作用。邵莹等［13］发现淡竹叶黄酮对大鼠心肌缺血再灌注损伤具有保护作用；李玉田等［14］在苦荞麦黄酮对家犬肾缺血的影响研究中发现苦荞麦黄酮具有一定的抗缺血作用。黄叶梅等［15］发现苦荞黄酮可以保护缺血再灌注后大鼠脑组织的损伤，但有关苦荞麦黄酮的相关作用未见报道，据此本文以苦荞麦黄酮为研究对象探讨其对心肌缺血再灌注损伤的保护作用。

本实验采用大鼠冠脉结扎45 min，再灌注60 min的方法制备心肌缺血再灌注动物模型，观察苦荞麦黄酮对该动物模型的影响。心功能的改变是本病重要表现之一［16］。在反映心功能状态的指标中，LVSP和+dp/dtmax反映心脏的收缩功能，LVEDP和-dp/dtmax反映心脏的舒张功能。本研究结果显示，模型组的LVSP、+dp/dtmax和-dp/dtmax明显降低，LVEDP明显升高，即心脏发展张力降低，静止张力升高，心肌收缩功能下降，出现心功能障碍，提示心脏功能受损；而黄酮组能明显升高LVSP、+dp/dtmax、和-dp/dtmax，降低LVEDP值，表明苦荞麦黄酮可以改善MIRI引起的心脏舒缩功能，改善心功能状态。

氧自由基的产生和脂质过氧化反应是MIRI的主要机制［17］。SOD和MDA是反映氧化损伤的两个重要生化指标。SOD是体内重要的抗氧化酶，可以有效清除氧阴离子自由基，对机体的氧化与抗氧化平衡起重要作用，其含量高低反映机体的抗氧化能力；MDA是脂质过氧化反应产物，其含量的变化可以间接反映机体受氧自由基攻击损伤的程度［18］。GSH-PX也是对抗机体活性氧的一道防线，可以清除由活性氧和OH诱发的脂质过氧化物，起到保护细胞结构和功能的重要作用。实验结果提示，模型组SOD、GSH-PX活性显著降低，MDA含量显著升高，细胞内氧自由基增加，同时脂质过氧化反应剧烈，导致心肌细胞受到损伤。而黄酮组SOD、GSH-PX的活性显著升高，MDA含量显著降低，表明苦荞麦黄酮可以有效清除氧自由基，抑制脂质过氧化反应，减轻心肌细胞的损伤。心肌酶LDH、CK是心肌细胞损伤程度的重要指标，当心肌细胞受损时，膜的完整性遭到破坏［19］，使心肌酶漏出胞外，致使血清中浓度升高，血清中心肌酶的量则反映了心肌受损伤的程度和心肌梗死程度［20-21］。本研究结果显示，与假手术组相比，模型组LDH、CK含量显著升高，说明缺血再灌引起心肌损伤，造成心肌梗死；与模型组相比，黄酮组LDH、CK含量显著下降，心肌梗死程度显著下降，说明苦荞麦黄酮对心肌细胞具有保护作用，减轻心肌细胞受损。NO可以有效对抗氧自由基的损害，对缺血再灌注后心肌有正性肌力作用。本研究结果显示，与假手术组相比，模型组NO含量显著下降，黄酮组与模型组相比NO含量显著升高。说明苦荞麦黄酮可以减少氧自由基的生成并加速清除，增强心肌抗氧化能力，改善心脏功能。

综上可知，苦荞麦黄酮对心肌MIRI大鼠的心肌具有保护作用，能够改善MIRI大鼠的心功能。其机制可能与苦荞麦黄酮可以提高氧自由基清除能力，抑制氧自由基产生，增强心肌抗氧化能力，降低脂质过氧化损伤、增强NO水平，减轻心肌梗死程度有关。本实验结果为苦荞麦黄酮的临床应用提供研究依据，对寻找安全有效的保护心肌MIRI的药物具有重要的意义。

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The Effects of Buckwheat Flavonoids on Cardiac Function in Rats with Myocardial Ischemia/ReperfusionInjury

PAN Jiaxi，YE Xiangyang，WANG Yongguang，et al.The Third Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University，Zhejiang，Ruian 325200，China

Objective：To observe the protective effect of buckwheat flavonoids on myocardial ischemia reperfusion injury in rats.Methods：30 SD rats were divided into the sham operation group（SHAM group），the model group（MIRI group）and the buckwheat flavonoids treatment group（BWF group）randomly.We used the methods of ligatured the coronary artery 45min and reperfusion 60 min to establish the model of myocardial ischemia reperfusion injury to observe and record the hemodynamic parameters（LVSP，LVDEP and±dp/dtmax）changes under the condition of ischemia and reperfusion.Serum lactate dehydrogenase（LDH），creatine kinase（CK），superoxide dismutase（SOD），malondialdehyde（MDA），glutathione peroxide（GSH-PX）and nitric oxide（NO）content were measured，and the degree of myocardial infraction was calculated with TTC method to observe the protective effect of buckwheat flavonoids on myocardial ischemia reperfusion injury in rats.Results：Compared with the MIRI group，the LVSP and the absolute value of±dp/dtmax were increased significantly；the LVEDP value was decreased significantly in BWF group.The BWF group reduced the content of LDH，CK，MDA，increased the content of SOD，GSH-PX and NO significantly，and reduced the extent of myocardial infarction.Conclusion：The buckwheat flavonoids have a protective effect on myocardial ischemia reperfusion injury in rats.The mechanism may be related to buckwheat favnoids'improving the oxygen free radical scavenging ability，the inhibition of oxygen free radical，reducing lipid peroxidation，and enhance the level of NO.

Buckwheat flavonoids；Myocardial ischemia reperfusion；Heart function

R285.5

A

1004-745X（2015）09-1509-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.09.002

2015-04-08）

国家自然科学基金（81070155）

（电子邮箱：404078964@qq.com）