PNL2在皮肤黑素瘤的表达及与预后的相关性

康晓静刘广勇柴 莉彭吕娇王 朋赵 娟靳 颖

PNL2在皮肤黑素瘤的表达及与预后的相关性

康晓静1刘广勇2柴 莉1彭吕娇1王 朋1赵 娟1靳 颖1

目的： 检测PNL2在皮肤黑素瘤中的阳性表达率，明确其与预后的关系。方法： 采用免疫组织化学SP法检测PNL2在60例皮肤黑素瘤石蜡包埋组织切片中的表达，并分析PNL2在不同年龄、性别、民族、发病部位、淋巴结转移、Clark分级、浸润深度及预后的相关性。结果： PNL2在皮肤黑素瘤中的阳性表达率为90%，与淋巴结转移、Clark分级、浸润深度及预后密切相关（P＜0.05），与年龄、性别、民族、发病部位不相关（P＞0.05）。结论： PNL2与皮肤黑素瘤的病情发展及预后具有相关性。

皮肤黑素瘤； PNL2； 侵袭； 预后

PNL2是针对黑素细胞抗原的一种新单克隆抗体。目前国内外对PNL2的研究报道较少，与PNL2相对应的抗原尚未明确。PNL2染色不会因为组织标本的漂白或脱钙作用而改变，有利于PNL2对发生于高度染色细胞组织病变的黑素瘤和发生骨转移病变黑素瘤进行免疫检测的诊断。PNL2在黑素瘤诊断中显示出高度灵敏度和特异性，对诊断黑素瘤具有很大价值。1，2目前，黑素瘤中PNL2表达情况与黑素瘤临床表型的相关性研究甚少。本研究用免疫组化方法检测60例皮肤黑素瘤组织中 PNL2的表达，探讨PNL2的表达与皮肤黑素瘤的诊断、临床病理特征、预后的关系及意义。

1　资料与方法

1.1研究病例 60例明确诊断为皮肤黑素瘤的石蜡包埋组织均选取新疆维吾尔自治区人民医院病理科及皮肤科2004年1月至2013年12月存档蜡块，病史完整。所有标本均经HE及病理诊断证实。60例皮肤黑素瘤患者均未做化疗、放疗及抗免疫治疗。其中维吾尔族29例，汉族31例；男32例，女28例；年龄22～94岁，平均57.5岁；肢端型42例，非肢端型18例；浸润深度：组织学表现为原位皮肤黑素瘤（肿瘤细胞未突破基底膜）16例，侵袭性皮肤黑素瘤（肿瘤细胞突破基底膜向真皮内侵袭）44例。组织学Clark分级：I-III级17例，IV-V级43例；伴随淋巴结转移22例，无淋巴结转移38例；3年内随访出现多器官转移或死亡29例，预后良好14例，失访17例。

主要试剂 一抗是小鼠抗人皮肤黑素瘤PNL2单克隆抗体（IgG，产地英国，产品编号：ab12502）；鼠兔通用型二抗，二氨基联苯胺（DAB）显色剂均购自上海艾博抗贸易有限公司。

1.2方法 免疫组织化学法将10%福尔马林固定、石蜡包埋的皮肤黑素瘤组织制成4～5μm切片，常规烤片、脱蜡、水化；浸入0.01 mol/L，pH值为6.0的枸橼酸盐缓冲液内，热抗原修复3 min；3%H2O2室温作用10min以消除内源性过氧化氢酶；滴加一抗（稀释度为1∶800）；4℃过夜后在室温复温20 min后滴加1 mmol EDTA缓冲液，滴加一抗（稀释度为1∶10-1∶25）调pH值为9.0的稀释液中进行原位染色，热抗原修复3min；室温孵育30～60 min；DAB显色1 min左右；自来水冲洗，苏木精复染，通透、脱水，中性树胶封片，显微镜下观察结果。PBS代替一抗作为空白对照，已知PNL2染色阳性的皮肤黑素瘤切片作为阳性对照。

结果判断：所有切片做免疫组化前均现切现用，所有免疫组化结果由2位病理科专家双盲阅片判读结果，PNL2阳性染色为棕黄色颗粒，主要定位于细胞质。观察全片，借助高分辨显微镜随机取不重叠的5个200倍视野，得出阳性细胞所占百分比。采用半定量积分法，对每张切片的阳性细胞率及阳性细胞着色强度进行分级计分。染色强度分为3级：无着色0分，浅着色1分，棕黄色2分；按阳性细胞百分比分4级：＜5%为0分，5%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，＞75%为4分。每张切片最后的得分为两次评分的乘积：≥3分是阳性，＜3分是阴性。

1.3统计学方法 用SPSS l7.0统计软件进行分析，采用χ2检验四格表确切概率法分析皮肤黑素瘤中与不同年龄、性别、民族、发病部位、淋巴结转移、Clark分级、浸润深度及预后中PNL2表达的差异，P＜0.05差异有统计学意义。

2　结果

2.1PNL2在皮肤黑素瘤组织中表达分析 60例皮肤黑素瘤石蜡包埋组织中，PNL2阳性表达54例，表现为胞浆的棕黄色颗粒状着色，表达率为90%（54/ 60）（图1）。

图1　PNL2表达阳性：细胞浆出现棕黄色颗粒（HE，a×100，b×400）

2.2皮肤黑素瘤组织中PNL2的表达与临床病理特征关系 PNL2阳性表达的皮肤黑素瘤组织与淋巴结转移、Clark分级及预后存在差异，差异有统计学意义（P＜0.05），且PNL2的阳性表达率随皮肤黑素瘤组织Clark分级升高及浸润深度加深而增高。见表1、2。PNL2的阳性率表达在不同年龄、性别、民族、发病部位之间分布无明显差异（P＞0.05）。见表1。

表1　皮肤黑素瘤PNL2表达与临床病理特征的关系

表2　皮肤黑素瘤PNL2表达与临床预后的关系

3　讨论

生物学标记物是近年来医学研究领域上的热点。大多数的黑素瘤标记物其灵敏度和特异性有限。探索黑素瘤的病因及发病机制，以期找到黑素瘤早期有效诊断指标及分子靶向治疗方法已成为目前治疗黑素瘤中迫切的问题。

PNL2单克隆抗体是相对较新的黑素瘤标记物，目前认为可作为转移性黑素瘤诊断的补充标记物。最初，PNL2是以人生长抑素受体为抗原而生产的单克隆抗体，理论上该重组蛋白可以与人生长抑素受体第2亚型（SST2）的羧基端相结合。最终发现PNL2不能与SST2相结合，但可以与黑素细胞和粒细胞中的某种未知抗原相结合。3目前与PNL2相对应的抗原尚未明确，但资料显示PNL2相对应的抗原与HMB -45/MelanA相对应的抗原 PMEL17/gp100是不同的。4有猜测是与PNL2相对应的抗原具有与TAP1或网格蛋白17相同的分子量，而被这些大量的蛋白所掩盖。5PNL2对黑素瘤具有高度特异性。Busam等1对38例黑素瘤样本研究发现PNL2阳性表达率为87%、Melan-A阳性率为82%、HMB-45阳性率为76%、酪氨酸酶阳性率为92%、MITF阳性率为82%。Rochaix等5对49例黑素瘤样本进行免疫组化实验研究发现PNL2阳性表达率为94%、Melan-A为90%、HMB-45为90%。在这些样本中PNL2比HMB-45具有更强的一致性和阳性表达率，在49个样本中有1例黏膜黑素瘤PNL2呈阳性表达。本研究显示60例皮肤黑素瘤样本中PNL2的阳性表达率高达90%（54/60），进一步说明PNL2对皮肤黑素瘤具有高度灵敏性。PNL2更易染色于真表皮连接处和上皮样黑素瘤。另外PNL2也是血管周上皮样细胞肿瘤的很好的补充标记物。

PNL2仅染色于黑素细胞病变、透明细胞肉瘤、黑素性神经鞘瘤、血管肌脂肪瘤和淋巴管肌瘤病，而其他非黑素细胞肿瘤的研究均为阴性。6PNL2与MelanA，HMB-45抗体有着相似的特异性，但PNL2着色强度及一致性都强于HMB-45抗体。同时HMB-45表现阴性的黑素瘤在PNL2表现出强阳性。7Aung等8研究发现214例转移性黑素瘤中PNL2阳性表达率为89%（190/214），其中对KBA62、S100、HMB45、MelanA、MITF及酪氨酸酶呈阴性反应的黑素瘤中PNL2的阳性表达率分别为83%（25/30）、70%（7/10）、25%（7/28）、44%（12/27）、52%（16/31）及25%（4/16）。除了上述S100标记物外对剩余的标记物全部显示阴性的黑素瘤标本中PNL2阳性反应率为10%（1/10）。PNL2在淋巴管肌瘤病，血管平滑肌脂肪瘤非黑素细胞病变着色仍强于 HMB-45抗体。9进一步说明PNL2对黑素瘤的诊断具有优越性。

有报道称与HMB-45和Melan-A相比，PNL2对黑素瘤具有更高的特异性，远远优于S-100。目前对PNL2在黑素瘤免疫反应的调查结果显示PNL2是一种具有高度灵敏性和特异性的黑素瘤标记物，其在大多数原发性上皮样黑素瘤中常呈阳性反应（78%～100%）。1，3，5在转移性黑素瘤中阳性反应率约为75%～100%。1，5，8非促结缔组织增生梭形细胞黑素瘤也常呈阳性反应（80%）。1类似于其它黑素瘤标记物，PNL2阳性反应也可见于透明细胞瘤5，8、肾血管平滑肌脂肪瘤5、淋巴管肌瘤病5、黑素细胞性神经鞘瘤。1，5其它所有的非黑素细胞肿瘤的研究包括各种类型的肿瘤、软组织癌、成神经细胞瘤、嗜络细胞瘤和神经胶质瘤其PNL2反应为阴性。1，5，8

Clark分级、淋巴结转移、浸润深度是影响黑素瘤预后的重要因素。本研究显示PNL2阳性表达的皮肤黑素瘤患者多伴随淋巴结转移，且皮肤黑素瘤PNL2阳性表达率随Clark分级升高及浸润深度加深而增高。PNL2阳性表达与预后具有高度相关性，有望成为一个重要的皮肤黑素瘤预后预测指标。本研究及其他文献研究显示的PNL2在皮肤黑素瘤中阳性高表达，说明PNL2对皮肤黑素瘤具有高度灵敏性和特异性，提示PNL2可作为皮肤黑素瘤临床诊断潜在的补充标记物。

1 Busam KJ，Kucukgöl D，Sato E，et al.Immunohistochemical analysis of novelmonoclonal antibody PNL2 and comparison with other melanocyte differentiation markers.Am J Sun Pathol，2005，29（3）：400-406.

2 Nonaka D，Laser J，Tucker R，et al.Immunohistochemical evaluation of necrotic malignant melanomas.Am J Clin Pathol，2007，127（5）：787-791.

3 Morris LG，Wen YH，Nonaka D，et al.PNL2 melanocytic marker in immunohistochemical evaluation of primary mucosal melanoma of thehead and neck.Head Neck，2008，30（6）：771-775.

4Ordóñez NG.Value ofmelanocytic-associated immunohistochemicalmarkers in the diagnosis of malignant melanoma：a review and update.Hum Pathol，2014，45（2）：191-205.

5 Rochaix P，Lacroix-Triki M，Lamant L，et al.PNL2，a new monoclonal antibody directed against a fixative-resistantmelanocyte antigen.Mod Pathol，2003，16（5）：481-490.

6Ramos-Vara JA，Frank CB，DuSold D，et al.Immunohistochemical expression of melanocytic antigen PNL2，melan A，S100，and PGP 9.5 in Equine Melanocytic Neoplasms.Vet Pathol，2014，51（1）：161-166.

7 Ramos-Vara JA，Miller MA.Immunohistochemical identification of canine melanocytic neoplasms with antibodies to melanocytic antigen PNL2 and tyrosinase：Comparison with melan A.Vet Pathol，2011，48（2）：443-450.

8 Aung PP，Sarlomo-Rikala M，Lasota J.KBA62 and PNL2：2 New melanoma markers immunohistochemical analysis of 1563 tumors includingmetastatic，desmoplastic，andmucosalmelanomas and theirmimics.Am J Surg Pathol，2012，36（2）：265-272.

9Giudice C，Ceciliani F，Rondena M.Immunohistochemical investigation of PNL2 reactivity of canine melanocytic neoplasms and comparison with melan a.JVet Diagn Invest，2010，22（3）：389-394.

（收稿：2015-05-05 修回：2015-06-04）

The expression of PNL2 and the correlation with prognosis ofmelanoma

KANG Xiao-jing，LIUGuang-yong，CHAILi，etal.DepartmentofDermatology，People'sHosptilalofXinjiang Uyqur Autonomous Kegion

Objective：To detect the expression of PNL2 in cutaneousmalignantmelanoma（MM）and to determine the relationship with the disease progression and prognosis.M ethods：The expression of PNL2 in paraffin-embedded tissue samples from 60 cases of MM was detected with immunohistochemistry.The correlation between PNL2 expression and age，gender，ethnicity，pathogenic site，lymph node metastasis，Clark grade，infiltration and prognosiswas analyzed.Results：The positivity rate of PNL2 was90%inmelanoma tissue.The PNL2 expression was positively correlated with lymph nodemetastasis，Clark grade，depth of invasion and prognosis（P＜0.05），but uncorrelated with age，gender，ethnicity and pathogenic site（P＞0.05）. Conclusion：PNL2 is correlated with the disease progression and prognosis in cutaneous MM.

melanoma；PNL2；invasion；prognosis

乌鲁木齐市科学技术计划项目（编号：G131310001）

国家临床重点专科建设项目经费资助

1新疆维吾尔自治区人民医院皮肤科，乌鲁木齐，830001

2山东省聊城市第二人民医院风湿科，聊城，252000