利用锁核酸探针技术快速检测肉制品中猪源性成分

周广彪 许如苏 魏霜 段建发 陈文婉

（汕头出入境检验检疫局 广东汕头 515031）

利用锁核酸探针技术快速检测肉制品中猪源性成分

周广彪 许如苏 魏霜 段建发 陈文婉

（汕头出入境检验检疫局 广东汕头 515031）

［目的］建立快速检测肉制品中猪源性成分的锁核酸探针荧光PCR检测方法。［方法］基于猪线粒体基因组的保守序列，设计特异性引物和锁核酸探针，建立快速检测肉制品中猪源性成分的锁核酸荧光PCR检测方法。通过特异性、灵敏度、重复性测试及应用检测对建立的方法进行评价。［结果］建立的锁核酸荧光PCR方法对牛、羊、马、鸡、鸭、鹅均无非特异性扩增；该法可检测低至1.20 pg的猪肉DNA，重复检测结果的变异系数均小于1%。应用该法检测市售肉制品50份，32份标示含有猪肉成分样本的检测结果均与预期相符，另发现1份羊肉丸为猪肉制备、2份鸡肉火腿肠中掺有猪源性成分而未标示。［结论］本研究建立的方法具有特异、灵敏、稳定等优点，适用于大规模快速检测肉制品中猪源性成分。

猪源性成分；锁核酸探针；肉制品

1 前言

随着一些以猪肉假冒牛羊肉、鼠肉假冒猪肉等不法事件的曝光，人们对此类食品安全问题的关注也大为增加，食品中猪源性成分检测的意义也逐渐为人知晓。虽然有环介导等温扩增（LAMP）等新型应用检测技术，但纵观现行国家标准及行业标准，荧光PCR技术或普通PCR技术仍是猪源性成分检测的主流［1-5］，其中荧光PCR技术因为操作便捷、无需接触EB等DNA显色类毒性物质，应用越来越广泛。

琐核酸（Locked Nucleic Acid，LNA）是一种近几年发展起来的核酸化学修饰技术（第三代反义寡聚核苷酸），即通过一个亚甲基桥将核糖的2'氧原子和4'碳原子连接起来，形成锁状结构。相比较被广泛使用的Taqman探针，LNA探针具有较好的热稳定性和杂交的特异性，可避免普通DNA探针设计缺陷而无法解决的特殊序列问题，在病原检测［6-9］、基因突变检测［10，11］等方面已有成功应用的例子，但未见在动物源性成分检测领域的研究报道。本研究旨在利用LNA荧光探针的上述优点，建立肉制品中猪源性成分的Taqman-LNA荧光PCR检测方法，为动物源性成分的检测提供新的技术手段。

2 材料与方法

2.1材料

2.1.1实验材料

测试样本均购自汕头本地超市和农贸市场。取牛、羊、马、鸡、鸭、鹅鲜肉样本进行特异性检测；取肉肠、肉松、肉丸等肉制品50份进行应用检测；以屠宰场现杀猪肉为猪源性成分检测的阳性样本。

2.1.2主要试剂

核酸提取试剂盒：达安基因，DA-Z146；2×PCR Master Mix：Takara，RR390A；Real Time PCR Porcine DNA Detection Kit（猪源性成分检测试剂盒）：Takara，RR912；无水乙醇：分析纯，广州化学试剂厂。2.1.3主要仪器和设备

LightCycler®480型荧光定量PCR仪：Roche；高速离心机：Beckman；恒温干热器：Eppendorf。

2.2方法

2.2.1样品制备和DNA提取

取样品25-30 g，参照文献［12］制成1∶4（M/V）肉浆。吸取50μL中层悬浊液，使用核酸提取试剂盒进行DNA提取。

2.2.2Taqman-LNA荧光PCR扩增检测

2.2.2.1引物和探针

从GenBank上查找并下载家猪线粒体基因组全序列（Sus scrofa domesticus mitochondrion，complete genome），再获取近五年的各地及各类猪线粒体DNA全序列120份，使用ClustalX软件进行序列比对。再依据筛选出长度超过80 bp的保守序列，使用Primer Express软件设计引物探针。设计出的引物和探针在NCBI网站上进行同源性比对，从理论上测试和验证序列的种属特异性并据此调整引物和探针的设计。

确定的上游引物为5'-CAGCAACCGTATTCACAGGAT-3'，下游引物为5'-GGCTACTG GTTGAATAAATAGGC-3'，LNA探针5'-FAM-TT TCTACCACAA+GGAACACCCGCC-BHQ1-3'，引物和探针均由上海辉睿生物科技公司合成。

2.2.2.2最适引物和探针浓度的筛选

根据反应体系酶的特性、荧光PCR仪的特点和引物Tm值设定的预反应条件为：95℃预变性1 min；95℃5 s，60℃25 s（荧光采集FAM通道），共循环40次。设置PCR总体系20 μL，使用确证样本DNA模版1 μL，测试引物浓度（0.4-1.2 μmol/L）、探针浓度（0.1-0.8 μmol/L）的两两配对反应，根据Ct值的大小、扩增曲线的形状和荧光增量大小确定最适引物和探针浓度。

2.2.2.3退火温度的优化

使用阳性样本DNA，以1℃为变化范围测试52℃-67℃区间的退火温度对Taqman-LNA荧光PCR扩增的影响。根据Ct值的大小、扩增曲线的形状和荧光增量大小确定最佳退火温度。

2.2.2.4特异性试验

以马、牛、羊、鸡、鸭、鹅的DNA为模板，进行Taqman-LNA荧光PCR试验以验证方法的特异性。

2.2.2.5灵敏度和重复性测试

将阳性样本DNA做10×系列稀释，制备相对含量分别为100%、10%、1%、0.1%、0.01%、0.001%及0.0001%的7个梯度测试样本，各重复检测3次，考察方法的灵敏度，并计算不同浓度DNA检测Ct值的变异系数CV：CV=标准差（SD）/Ct的平均值（X）。

2.2.2.6应用检测

按2.2.1提取50份市售肉制品的DNA，采用本方法进行猪源性成分检测，并用前述商品化Taqman荧光PCR试剂盒（Takara，RR912）进行验证比对。

3 结果

3.1引物和探针浓度的优选

引物和探针的两两配对结果显示，当上、下游引物终浓度为1.0 μmol/L、探针终浓度为0.3 μmol/L时，扩增效率高，Ct值较小，且可获得典型的倒S形扩增曲线。故将此引物和探针浓度设为Taqman-LNA荧光PCR检测方法的最佳组合。

3.2退火温度的优选

结果表明，当退火温度在57℃-61℃之间时，Ct值和扩增曲线的荧光增量差异不明显，但以59℃时的Ct值、荧光增量及倒S形曲线为最佳。63℃以上和55℃以下的Ct值明显增大或扩增曲线形状欠佳。

3.3Taqman-LNA荧光PCR反应体系和反应条件的确定

根据3.1和3.2的试验结果，确定Taqman-LNA荧光PCR的反应体系为：2×PCR Master Mix 10 μL，上、下游引物（10 μmol/L）1.0μL，探针（10 μmol/L）0.3 μL，DNA模板1 μL，补水至20 μL；反应条件为：预变性95℃1 min；95℃5 s，59℃25 s（收集FAM荧光信号），40个循环。

3.4特异性试验结果

试验结果只有猪肉的阳性样本出现典型扩增曲线，而牛、羊、马、鸡、鸭、鹅均无扩增曲线，详见图1。结果表明，本研究所设计的引物和探针具有很好的特异性。

图1　特异性试验扩增曲线

3.5灵敏度试验结果

实验中各梯度测试样本的模板DNA量分别为120ng、12ng、1.2ng、0.12ng、0.012ng、1.2pg和0.12pg，相当于猪肉含量为100%、10%、1%、0.1%、0.01%、 0.001%和0.0001%。反应的扩增曲线见图2。由图2可见，本方法可检测到猪肉DNA最低含量为1.2 pg，相当猪肉含量为0.001%（以阳性样本DNA做10×系列稀释为计）。

图2　猪肉DNA 10倍系列稀释的Taqman-LNA荧光PCR扩增曲线

3.6重复性试验结果

将上述灵敏度测试所得的3次重复数据进行统计分析，计算不同浓度检测Ct值的变异系数如表1。从表1中可见，当猪肉DNA含量在1.2 pg及其以上时，重复检测结果的变异系数均小于1%，表明该方法具有较好的稳定性。

表1　重复性试验结果

3.7应用检测结果

应用该法检测本市农贸市场和超市销售的肉丸、肉肠、肉松等肉制品50份，其中32份标示含有猪肉成分样本的检测结果均与预期相符，在1份羊肉丸中未检测到羊源性成分但有猪源性成分，2份鸡肉火腿肠中掺有猪源性成分而未标示。所有检测结果均与商品化Taqman荧光PCR检测试剂盒（Takara，RR912）的验证结果相一致。

4 讨论

4.1目的基因的选择

在动物源性成分检测领域，核基因组DNA和线粒体DNA均有较多的检测应用［13-17］。相对而言，线粒体基因具有拷贝数高、不易降解破坏等优点，更适用于加工肉制品的检测。国家标准《明胶中牛、羊、猪源性成分的定性检测方法-实时荧光PCR法》（GB/T 25165-2010）检测的是猪核基因组朊蛋白基因，本研究用该标准检测市售生鲜猪肉的Ct值为25左右，扩增效率明显偏低，在检测一些猪肉含量较低的肉肠和肉丸样本时，很难区分弱阳性结果和假阳性结果。所以，本研究以线粒体基因为靶序列，汇总GeneBank上百余种猪线粒体DNA全序列，借助序列比对和引物设计软件筛选出引物和探针序列，特异性扩增猪线粒体DNA保守序列，进行肉制品中猪源性成分的检测。

4.2制样方式及DNA提取初始量的选择

本方法取样品25-30 g与水按照1∶4（M/V）制备匀浆，再取50 μL中层悬浊液进行DNA提取，相当于DNA提取的初始量为10 mg。因为在实验中发现，使用常规的制样设备很难直接将某些肉制品（如牛筋丸）彻底破碎，这给后续的DNA提取带来较大偏差，而加水后匀浆可容易制备相对均一的悬浊液。使用50 μL制样（相当10 mg）进行DNA提取，是因为建立的Taqman-LNA荧光PCR扩增效率较高，使用较少的样本量便可稳定重现测试结果，也可降低检测过程中发生污染的可能性。

4.3应用检测情况

本研究共检测市售肉制品50份，阳性结果的ct值大约在21-23之间，略高于新鲜猪肉的ct值结果（ct值＜20）。检测发现1份羊肉丸实为猪肉丸，另有2份鸡肉火腿肠含有猪源性成分而未标识，其余的阳性结果均与标识成分相符。该检测情况也与多位学者的报道一致，一方面部分肉制品中添加了较多的其他成分，猪肉含量较低；另一方面加工处理又破坏了部分DNA的完整性，某些配料或添加剂也可能会影响DNA的提取或抑制PCR反应，这些应该是导致上述检测差别的主要原因。所有检测结果均与商品化Taqman荧光PCR检测试剂盒（Takara，RR912）的验证结果一致，但Taqman-LNA荧光PCR法的试剂成本却不足市售试剂盒的六分之一（8元/反应vs.50元/反应），具有明显的价格优势，更适用于大规模的检测应用。

5 结论

建立的Taqman-LNA荧光PCR方法具有很好的特异性；方法的灵敏度高，可检测0.001%的猪源性成分；重复性检测和应用检测效果良好；成本低，适用于大规模检测应用。

［1］SN/T 3730.8-2013食品及饲料中常见畜类品种的鉴定方法第八部分：猪成分检测实时荧光PCR法［S］.

［2］GB/T 25165-2010明胶中牛、羊、猪源性成分的定性检测方法实时荧光PCR法［S］.

［3］SN/T 2051-2008食品、化妆品和饲料中牛羊猪源性成分检测方法实时PCR法［S］.

［4］GB/T 21101-2007动物源性饲料中猪源性成分定性检测方法PCR方法［S］.

［5］GB/T 21103-2007动物源性饲料中哺乳动物源性成分定性检测方法实时荧光PCR方法［S］.

［6］郭安，刘志文，修贺明，等.基于通用探针库的实时荧光PCR技术快速检测阳性血培养瓶中的细菌病原体［J］.生物技术世界，2014，11：1-3.

［7］边立忠，宋广辉，赵素芝，等.LNA探针实时荧光定量PCR检测HBV DNA的研究［J］.中华临床医师杂志（电子版），2013，06：2501-2506.

［8］Letertre C，Perelle S，Dilasser F，et al.Evaluation of the performance of LNA and MGB probes in 5'-nuclease PCR assay［J］.Molecular and Cellular Probes，2003，17：307-311.

［9］秦智峰，刘建利，卢体康，等.基于锁核酸探针的双层荧光实时RT-PCR检测方法鉴别新城疫中强毒株和弱毒株［J］.中国预防兽医学报，2012，34（9）：719-723.

［10］曾勇彬.建立等位基因特异性锁核酸实时荧光定量PCR检测HBV YIDD耐药突变及其临床应用评价［D］.福建医科大学，2014.

［11］童永清，郑红云，李锋，等.LNA PCR检测骨髓增殖性疾病JAK2基因V617F突变［J］.微循环学杂志，2012，04：17-20.

［12］杨君娜，李家鹏，周彤，等.适于肉种掺杂比例实时荧光PCR测定的样品前处理方法［J］.肉类研究，2011，25（12）：25-28.

［13］何玮玲，黄明，张驰.食品中肉类成分种属鉴别技术研究进展［J］.食品科学，2012，33（3）：304-307.

［14］周彤，李家鹏，田寒友，等.一种基于实时荧光聚合酶链式反应的肉及肉制品中猪源性成分含量测定［J］.肉类研究，2013，27（12）：11-15.

［15］赵冉.动物产品中猪源性和牛源性成分双重荧光PCR检测方法的建立［J］.畜牧与饲料科学，2012，10：1-4.

［16］王颖，史艳宇，刘金华，等.荧光定量PCR方法检测畜肉食品中猪源性成分［J］.食品安全质量检测学报，2013，05：1529-1534.

［17］熊蕊，郭凤柳，刘晓慧，等.牛羊肉中掺杂猪肉的PCR方法的建立和初步应用［J］.食品工业，2014，08：199-202.

Development of a LNA-qPCR Method for Rapid Detecting Pig-Derived Ingredients in Meat and Products

Zhou Guangbiao，Xu Rusu，Wei Shuang，Duan Jianfa，Chen Wenwan
（Shantou Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Shantou，Guangdong，515031）

［Objective］To develop a LNA-qPCR method for rapid detection of pig-derived ingredients in meat and products.［Method］A LNA-qPCR method was developed for rapid detection of pig-derived ingredients in meat and products，using the pig-specific primers and locked nucleic acid probe designed for the conservative domain gene of pig mtDNA，and evaluated by sensibility，specificity，reproducibility and Practicability.［Results］The method had no cross-reaction with the ingredients derived from beef，mutton，horse，chicken，duck and goose.It could detect pig DNA as little as 1.20 pg and it was repeatable that the coefficients of variation were both less than 1%.The pig-derived ingredients were found in 32 meat products when detecting 50 meat products，which were in line with expectations.Also found 1 mutton pills was made of pork and 2 chicken ham sausage had pig-derived ingredients without any pigmeat in identification.［Conclusion］The LNA-qPCR established method was specific，sensitive，repeatable and accurate，and it was fit for large detecting pig-derived ingredients in meat and products rapidly.

Pig-Derived Ingredients；Locked Nucleic Acid Probe；Meat and Products

TS207.3

E-mail：stjszxjy@st.gdciq.gov.cn

广东出入境检验检疫局科技计划项目（2014GDK24）

2015-04-20