HPLC指纹图谱在鉴别冬虫夏草上的应用

王君 曹晓钢 李建民 王顺芝

（西藏出入境检验检疫局 西藏拉萨 850002）

HPLC指纹图谱在鉴别冬虫夏草上的应用

王君 曹晓钢 李建民 王顺芝*

（西藏出入境检验检疫局 西藏拉萨 850002）

［目的］建立冬虫夏草HPLC指纹图谱，为其真伪鉴别提供有效方法，并定量测定其6种共有核苷类成分（尿嘧啶、尿苷、胸腺嘧啶、腺嘌呤、腺苷、虫草素）的质量。［方法］采用HPLC，色谱柱Waters Symmetry RP-C18（250×4.6 mm，5 μm），以乙酸缓冲盐（pH 6.5，A）-甲醇（B）为流动相，梯度洗脱，检测波长260 nm，柱温25℃，流速0.8 mL/min。应用中药色谱指纹图谱相似度计算软件对指纹图谱进行相似度评价、聚类分析。［结果］所建立的方法重复性和精密度良好，建立的冬虫夏草指纹图谱包含24个共有峰，各峰分离良好，确认出尿嘧啶、尿苷、胸腺嘧啶、腺嘌呤、腺苷、虫草素6个共有成分。考察了29批西藏冬虫夏草，3批西藏以外地区冬虫夏草，2批蛹虫草，1批假虫草的指纹图谱与冬虫夏草指纹对照图谱的相似度。通过相似度分析，能很好的区分冬虫夏草、蛹虫草和假虫草。［结论］所建立的方法简单可靠，可做为冬虫夏草真伪鉴定的有效实验方法和依据。

冬虫夏草；高效液相色谱法；指纹图谱；鉴别

1 前言

冬虫夏草为麦角菌科真菌冬虫夏草菌（Cordycepssinensis）寄生在鳞翅目蝙蝠蛾科蝠蛾属（Hepialus）幼虫上形成的虫生子囊真菌［1］。冬虫夏草是我国特有的珍稀名贵药材，现代药理学研究表明，冬虫夏草有调节人体免疫系统，抗肿瘤及抗氧化活性，调节肾功能，恢复肝功能，调节心血管功能等功效［2，3］。野生虫草本身资源极其有限，加之近年来产地受到气候等各方原因影响，生长环境遭严重破坏，冬虫夏草产量逐年下降，价格逐年上涨，致使一些不法商贩想尽一切办法制假售假，以次充好，甚至用和冬虫夏草形态相似的亚香棒虫草、新疆虫草、草石蚕、地蚕等来欺骗消费者，使消费者真假难辨。

中药指纹图谱是以中药材群体的共有相似性为理论基础，采用一定的分析手段，得到能够标示该中药特性共有峰的图谱，借以鉴别真伪，评价药材质量均一性和稳定性［4，5］。为了提供鉴别冬虫夏草的科学依据，本研究对冬虫夏草进行了高效液相色谱指纹图谱研究，评价了西藏冬虫夏草、西藏周边产区冬虫夏草、蛹虫草、假冬虫夏草的指纹图谱与冬虫夏草对照图谱的相似度，并考察了指纹图谱相似度在鉴别冬虫夏草上的应用价值，以期为鉴别冬虫夏草提供有效的实验方法。

2 材料与方法

2.1材料

2.1.1仪器

电子天平：Sartorius，BT 224s；液相色谱仪：SHIMADZU，SPD-20A；超声振荡器：昆山市超声振荡仪器有限公司，KQ-300DE；台式高速离心机：Hettich，Universal 320R；超纯水系统：Millipore，milli-Q；pH仪：Sartorius，820；真空抽滤泵及容器。

2.1.2试剂

乙腈、甲醇：色谱纯；乙酸铵、乙酸：分析纯；尿嘧啶、尿苷、胸腺嘧啶、腺嘌呤、腺苷、虫草素标准品：中国食品药品检定研究院。

2.1.3试样

本研究收集了32批样品，其中29批为西藏冬虫夏草主产区现场采购和市售样品（21批采自西藏冬虫夏草的主产区-那曲地区，3批采自林芝地区，3批采自昌都地区，2批采自日喀则地区），3批对比样品（西藏周边产区青海、四川的冬虫夏草样品），详见表1。

表1　供试样品来源列表

新鲜冬虫夏草样品取回，经去除泥沙、清洗干净后，自然风干至水分＜10%。将风干的供试样品粉碎，装入样品密封袋中，置于冰箱保鲜室储藏备用。

2.2方法

2.2.1指纹图谱色谱条件

色谱柱：Waters Symmetry RP-C18（250×4.6 mm，5 μm）；进样量：10 μL；流速：0.8 mL/min；柱温：25℃；检测时间：45 min；检测波长：260 nm；流动相：甲醇-0.01 mol/L乙酸铵缓冲液（pH6.5）。系统梯度洗脱，洗脱程序为：0-10 min，甲醇2%-5%；10-15 min，甲醇5%-8%；15-20 min，甲醇8%-10%；20-30 min，甲醇10%-15%；30-45 min，甲醇15%-20%。

2.2.2样品制备

取样品1 g于20 mL离心管中，加入20%甲醇水10 mL，称重；超声提取30 min，取出放冷，再称重；用体积分数为20%甲醇补足减重，摇匀，离心15 min（10000 r/min），取上清液过0.22 μm微孔滤膜，弃去初滤液，取续滤液为供试品溶液。

2.2.3混合标准品储备液制备

准确称取标准品尿嘧啶0.0048g，尿苷0.0560g，胸腺嘧啶0.0053 g，腺嘌呤0.0034 g，腺苷0.0700 g，虫草素0.0027 g，共同放置于100 mL容量瓶中，用20%甲醇水定容至刻度，混合标准品储备液中各物质的浓度分别为48 μg/mL、560 μg/mL、53 μg/mL、34 μg/mL、700 μg/mL、27 μg/mL。再转移10 mL混匀后的储备液至100 mL容量瓶中，用20%甲醇定容至刻度，混合标准品中间液中各物质的浓度分别为4.8μg/mL、56μg/mL、5.3μg/mL、3.4μg/mL、70 μg/mL、2.7 μg/mL。再将混合标准品中间液依次转移1、2、4、8、10 mL至10 mL容量瓶中，用20%甲醇水定容至刻度。

2.2.4稳定性实验

称取冬虫夏草夏草粉末1.0 g，按所确定溶剂及方法制备供试品溶液，用上述确定的色谱条件，分别于制样后0 h、6 h、12 h、24 h和48 h连续进样检测，以色谱峰的保留时间和峰面积为指标，计算其相对保留时间、相对峰面积和相对标准偏差（RSD）。

2.2.5精密度实验

称取冬虫夏草夏草粉末1.0 g，按所确定溶剂及方法制备供试品溶液，用上述确定的色谱条件，连续进样5次，以色谱峰的保留时间和峰面积为指标，计算其相对保留时间、相对峰面积和RSD。

2.2.6重现性实验

称取同一冬虫夏草夏草粉末样品5份，按照所确定的方法制备供试品溶液，用上述确定的色谱条件分别进样，以色谱峰的保留时间和峰面积为指标，计算其相对保留时间、相对峰面积和RSD。

2.2.7西藏冬虫夏草对照指纹图谱的建立

取29批西藏冬虫夏草按确定的提取方法制备供试样品溶液，并以确定色谱条件测定HPLC图谱，将数据导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版》中进行处理，建立西藏冬虫夏草对照指纹图谱。

2.2.8系统聚类分析

聚类分析根据数学上的距离关系，对研究样本信息进行分类，提取中药色谱指纹图谱的差异特征，在此次聚类分析中，应用SPSS软件中系统聚类法。先选取29批西藏冬虫夏草HPLC指纹图谱中分离度好，面积较大，峰面积变化明显的若干共有峰，6批对照样品如果在相应的保留时间没有色谱峰，峰面积以零表示。再将选取的各共有峰峰面积化为以对照峰峰面积为标准的相对峰面积，用SPSS中以欧氏距离平方为测度，进行聚类分析。

3 结果与讨论

3.1方法稳定性

分别在0 h、6 h、12 h、24 h和24 h进样测得的主要色谱峰相对保留时间和峰面积无明显变化，色谱峰相对保留时间的RSD值在0.04%-0.2%之间，色谱峰峰面积RSD值在0.7%-1.8%之间，表明方法稳定性良好。

3.2方法精密度

连续进样5次测得的主要色谱峰相对保留时间和峰面积无明显变化，色谱峰相对保留时间的RSD值在0.07%-1.6%之间，色谱峰峰面积RSD值在0.4%-2.3%之间，表明方法精密度良好。

3.3方法的重现性

同一个样品制备的5份供试样品溶液进样测得的主要色谱峰相对保留时间和峰面积无明显变化，色谱峰相对保留时间的RSD值在0.04%-0.2%之间，色谱峰峰面积RSD值在0.7%-2.7%之间，表明方法稳定性良好。

3.4西藏冬虫夏草对照指纹图谱的建立

将29批西藏冬虫夏草样品测定的HPLC图谱，导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版》中进行匹配后，10批西藏冬虫夏草指纹图谱峰形基本相似，呈现出较高的一致性和规律性，软件提取出了24个特征共有峰，详见图1。

图1　西藏冬虫夏草对照指纹图谱

3.5西藏冬虫夏草对照指纹图谱与29批西藏冬虫夏草样品指纹图谱的相似度

西藏冬虫夏草样品全谱与共有模式对照谱图的相似度在0.930-0.998之间，表现出很高的相似性。29批西藏冬虫夏草样品指纹图谱相似度见图2。

图2　29批西藏冬虫夏草指纹图谱与西藏冬虫夏草对照图谱的相似度

3.6西藏冬虫夏草对照指纹图谱与6批对比样品指纹图谱的相似度

西藏冬虫夏草对照图谱与对比样品的HPLC图见图3。从图3可以看出，西藏冬虫夏草的指纹图谱和四川、青海冬虫夏草的指纹图谱非常相似，和蛹虫草及假虫草的指纹图谱差别很大，详见表2。

图3　西藏冬虫夏草对照图谱与对比样品的HPLC图

表2　6批对照样品和西藏冬虫夏草对照图谱的相似度

西藏冬虫夏草与青海和四川冬虫夏草的相似度很高，均＞0.9，目前的指纹图谱和相似度分析方法还无法区别西藏和其他产区冬虫夏草。根据相似度计算软件算法特点：峰面积比较大的色谱峰，对整体相似度的影响较大，如果样品和对照指纹图谱有相同的，并且含量较高的成分，那样品和对照图谱就会有一个较高的相似度［6，7］。西藏、青海、四川的冬虫夏草图谱相似度很高，成分含量上有差别。含量最高的为10、15、20号峰，3个产地的冬虫夏草里都有，这3个峰占总峰面积的60%以上；但是虫草功效中的重要成分，有很多峰面积很小，比如虫草素在虫草中的含量仅为0.003-0.01 mg/g［8］，但含量较小的成分对相似度计算影响很小，含量很小的这些物质即使在图谱中表现为“有”或“无”，对最终的相似度也并没有影响，这也是用该方法容易得到较高相似度结果的原因。另有文献报道［9］，根据指纹图谱共有峰峰面积RSD值的显著变化来区分不同产地的冬虫夏草，但笔者认为该文献中取样量太少（青海冬虫夏草1份，西藏冬虫夏草1份，西藏那曲冬虫夏草1份），用1份样品来代表一个区域，代表性远远不够，因为从本研究的实验数据来看，即使一个区域的冬虫夏草各成分含量也未呈现出规律性变化，而且该文献中报道的共有峰峰面积的RSD值的变化并没有和地域呈现出统一性。

3.7西藏冬虫夏草聚类分析

选取12个特征共有峰，如图4所示，各特征共有峰峰面积化为以对照峰10号峰峰面积为标准的相对峰面积，结果见表3。

图4　西藏冬虫夏草对照指纹图谱

表3　35批样品共有峰相对峰面积

（续表3）

图5为系统聚类分析图，图5结果显示：35批样品被分为5群，其中32批冬虫夏草被分为L1、L3、L4群，2批蛹虫草被分为L2群，1批假虫草被分为L5群。结合相似度分析及聚类分析结果，建立的指纹图谱能够将冬虫夏草、蛹虫草及假虫草分别开。

图5　系统聚类分析图

西藏冬虫夏草在品质特征上呈现出一定的地域性特征，来自同一地区的样品的同源性较高。如：西藏以外地区的3批冬虫夏草样品全部聚类在L4群内，自成一群；那曲地区的21批样品，有19批聚于L1群内，占90%；昌都地区只采购1批样品，被并入L1群内；林芝地区4批样品有3批聚于L1群内，占75%；日喀则地区的3批样品有2批聚于L1群内，占66.7%；西藏地区冬虫夏草29批有24批聚于L1群内，4批聚于L3群类，1批聚于L4群类，总体来说符合相似度分析的结果。

3.86种共有核苷类物质的含量分析

西藏冬虫夏草样品和标准品的HPLC图谱见图6。

图6　西藏冬虫夏草样品和标准品的HPLC图谱

图6显示，6种标准物质在西藏冬虫夏草都含有，含量各有不同。标准品的出峰顺序依次为：尿嘧啶、尿苷、胸腺嘧啶、腺嘌呤、腺苷、虫草素。

将5种不同浓度的混合标准品工作液按照已确定的色谱条件进样，进行线性回归，6个标准品的线性范围及相关系数见表4。

表4　6种核苷物质的线性范围、回归方程及相关系数

以样品批次为横坐标，分别以表6中尿嘧啶、尿苷、胸腺嘧啶、腺嘌呤、腺苷、虫草素含量为纵坐标，绘制29批西藏冬虫夏草6个共有峰质量的折线图，见图7。

图7　29批西藏冬虫夏草中6种核苷类物质含量折线图

图7结果显示，29批样品中尿嘧啶含量为0.029-0.047 mg/g，尿苷含量为1.0-2.1 mg/g，胸腺嘧啶含量为0.11-0.38 mg/g，腺嘌呤含量为0.019-0.095 mg/g，腺苷含量为0.48-0.95 mg/g，虫草素含量为0.0027-0.013 mg/g。

4 结论

本研究建立了冬虫夏草的HPLC指纹图谱，同时还对主要核苷类成分进行测定，用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版》提取了24个共有特征峰。通过对29批西藏冬虫夏草、3批其他产地冬虫夏草、2批蛹虫草、1批假虫草与冬虫夏草指纹图谱的相似度比较，结果显示本研究建立的方法能区分冬虫夏草和蛹虫草、假虫草，但对不同产地的冬虫夏草区分度不够；聚类分析的结果与相似度分析结构基本一致。本研究所建方法为冬虫夏草的真伪鉴定提供了有效的实验方法，为冬虫夏草的产地区分提供了前期技术储备。

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Identification of Cordyceps sinensis by HPLC Fingerprint

Wang Jun，Cao Xiaogang，Li Jianmin，Wang Shunzhi*
（Tibet Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Lhasa，Tibet，850002）

［Objective］To establish HPLC fingerprints for indentification of Cordyceps sinensis in Tibet.［Methods］The HPLC analysis was performed on Waters Symmetry RP-C18 column（250×4.6 mm，5 μm）and detected at 260 nm.The mobile phase was consisted of methnol and acetate buffer（pH 6.5）using a gradient elution.The column temperature was 25℃，and the flow rate was 0.8 mL/min.The similarity of fingerprints was evaluated by the fingerprint similarity calculation software，then，duster analysis was studied.［Results］The precision and repeatability of the method were good as the relative standard deviation（RSD）of intrabatch was less than 5%.The fingerprints of 29 batches of Cordyceps sinensis in Tibet，3 Cordyceps sinensis from Sichuan and Qinghai，2 Cordyceps militaris，and 1 fake Cordyceps sinensiswerecomparedincharacteristiccomponentsandsimilarity.Theresultsdemonstratedthat CordycepssinensiswasdifferentiatedfromtheCordycepsmilitarisandfakeCordycepssinensis.［Conclusion］The method was simple，feasible and reproducible，and can be offered as technical basis for the identification of Cordyceps sinensis.

Cordyceps sinensis；HPLC；Fingerprint；Identification

TS201.6

E-mai：wangjun19830103@qq.com；*通讯作者E-mail：wangsz@xzciq.gov.cn

国家质检总局科技计划项目（2012IK191）

2015-08-08