中间型单核细胞及TREM-1在点滴状银屑病中的表达

钱 青白彦萍曹永彤高春岩申宇鸿

中间型单核细胞及TREM-1在点滴状银屑病中的表达

钱 青1白彦萍2曹永彤2高春岩1申宇鸿1

目的： 检测点滴状银屑病患者中间型单核细胞比例及其细胞表面触发受体（TREM-1）的表达，探讨其在点滴状银屑病疾病过程中的作用。方法： 采集28例点滴状银屑病患者和24例健康对照者外周血，流式细胞术检测中间型单核细胞及TREM-1+中间型单核细胞比。ELISA检测血清游离TREM-1（sTREM-1）浓度。计算中间型单核细胞与PASI评分及抗链球菌溶血素O（ASO）的相关性。结果： 点滴状银屑病患者中间型单核细胞比例及sTREM-1水平分别为13.5±4.8%和277.8 pg/mL，显著高于健康对照组的3.4±1.1%和162.6 pg/mL，（P＜0.05）；患者组TREM-1平均荧光强度及阳性中间型核细胞频率分别为24.8±7.2和80.4±6.8%，低于健康对照组的35.3±5.1和95.6±5.7%，（P＜0.05）。患者中间型单核细胞比例与PASI，ASO水平正相关。结论： 中间型单核细胞及其表面TREM-1受体可能参与点滴状银屑病的疾病过程。

髓系细胞触发受体-1； 中间型单核细胞； 点滴状银屑病

点滴状银屑病除了自身反应性T细胞活化和表皮角质形成细胞异常增殖，固有免疫系统因细菌、真菌等微生物感染引起过度活化在疾病过程中也发挥重要作用。1在炎症反应过程中，中间型单核细胞具有较强的抗原提呈和加工能力，具有较高的活化炎症反应的潜能；2单核细胞表面髓系细胞触发受体-1（TREM-1）具有激发和放大炎症反应的作用。3本次研究通过检测点滴状银屑病患者外周血中间型单核细胞比例及其TREM-1表达，并分析其与点滴状银屑病其他诊断指标或致病物质（如：抗链球菌溶血素O）的相关性，阐明中间型单核细胞在点滴状银屑病疾病过程中的作用。

1　材料与方法

1.1研究对象 选取点滴状银屑病患者28例，其中男12例、女16例，年龄（23.5±12.1）岁，同时设健康对照24例，其中男11例、女13例，年龄（24.5±14.2）岁，无自身免疫性疾病或近期感染史。两组间性别、年龄比较差异无统计学意义（P＞0.05）。本次研究经医院伦理委员会批准，征得患者知情同意，采集外周血3 mL。

1.2主要仪器与试剂 异硫氰酸荧光素（FITC）鼠抗人-CD14、叶绿素蛋白偶联物（PerCP-cy5.5）鼠抗人-CD16单克隆抗体及同型对照购自BD公司，PE-鼠抗人TREM-1及同型对照购自R&D公司；流式细胞仪FACSCanto为 BD公司产品。抗菌肽 LL-37及sTREM-1酶联免疫吸附试验（ELISA）检测试剂盒分别购自Hycult Biotech公司和R&D公司。

1.3方法

1.3.1流式细胞术检测细胞表面受体 每100μL外周血加入10μL PerCP-cy5.5-抗人CD16、FITC-抗人CD14和PE-抗人TREM-1及同型对照，室温避光孵育30 min，经红细胞裂解液破坏红细胞后，用1mL磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤两次，1500 rpm离心6 min，弃上清，加入400μL PBS重悬细胞。FACSCanto采用前向散射光（FS）和侧向散射光（SS）区别单核细胞（图1aR1），以中间型单核细胞设门（图1b R4），测定中间型单核细胞/单核细胞百分率，以及TREM-1+中间型单核细胞/中间型单核细胞百分率。

1.3.2银屑病相关诊断或评估指标 计算所有患者银屑病皮损面积和严重程度指数（PASI）。外周血经500×g离心5 min，分离血浆，储存在-80℃低温冰箱。按ELISA检测法检测sTREM-1，每标本测2次，取均值。抗链球菌溶血素O（ASO）采用免疫比浊法，BNProSPec特定蛋白分析仪及配套试剂检测。

1.4统计学方法 用Stata 7.0统计软件对数据进行正态性检验，本次研究全部为计量资料，正态性分布用¯x±s表示，两组比较采用students't-test检验；偏态资料用中位数（M）表示，两组比较采用Mann-Whitney U test，作双侧检验。线性相关系数计算采用Pearson相关系数。取P＜0.05作为差异有统计学意义的标准。

2　结果

2.1流式细胞术检测中间型单核细胞比例 点滴状银屑病患者中间型单核细胞比例（3.5±4.8%）高于健康对照组（3.4±1.1%），差异有统计学意义（P＜0.01）（图1d）。

图1　a：流式细胞仪采用FS和SS区别单核细胞（R1）；b：健康对照者中间型单核细胞（R4）；c：点滴状银屑病患者中间型单核细胞（R4）；d：两组中间型单核细胞比例比较

2.2中间型单核细胞TREM-1表达 流式细胞仪以中间型单核细胞设门，测定TREM-1+中间型单核细胞/中间型单核细胞百分率（图2a）和TREM-1 MFI平均荧光强度（图2b）。

图2　a：患者中间型单核细胞TREM-1表达；b：对照组中间型单核细胞TREM-1表达

点滴状银屑病患者中间型单核细胞TREM-1阳性比例及平均荧光强度（MFI）均低于健康对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），结果见表1。

表1　中间型单核细胞TREM-1表达

2.3ELISA检测血清sTREM-1浓度 点滴状银屑病患者血清sTREM-1浓度为152.5～372.4 pg/mL，平均为277.8 pg/mL，对照组浓度为124.3～209.7 pg/ m L，平均为162.6 pg/m L。经Mann-Whitney U test检验，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.4患者中间型单核细胞比例与临床数据相关性分析 点滴状银屑病患者中间型单核细胞比例与血清sTREM-1浓度、ASO、PASI呈正相关（图3）。

图3　a：中间型单核细胞与sTREM-1相关性分析；b：中间型单核细胞与ASO相关性分析；c：中间型单核细胞与PASI相关性分析

3　讨论

单核细胞根据其表面标记CD14、CD16分为3个亚群：经典型（CD14highCD16-）、中间型（CD14highCD16+）和非经典型（CD14lowCD16++），分别约占外周血单核细胞的85%、5%和10%，不同的亚群在表型、功能及炎症活化潜能方面存在明显差异。5经典型具有很强的吞噬功能；非经典型高表达细胞骨架能动性相关基因，能识别炎症信号并迅速迁移到炎症部位，浸润组织后分化为巨噬细胞。中间型单核细胞高表达编码MHC-II类分子相关基因（如HLA-DR和CD74），具有较强的抗原提呈和加工能力，并在T细胞活化、增殖及抗原提呈过程中起重要作用。此外，还表达促血管生成的相关分子，具有促血管生成的特性。4本次研究发现，点滴状银屑病患者外周血中间型单核细胞比例明显升高。Fujisawa等6研究证实，泛发性脓疱型银屑病患者外周血中间型单核细胞比例明显升高。

TREM-1表达于中性粒细胞和单核巨噬细胞等细胞表面，具有激发和放大炎症反应的作用，在炎症反应过程中，通过基质金属蛋白酶的水解，膜表面TREM-1从细胞表面脱落下来，形成sTREM-l，从而下调炎症反应，是机体在炎症反应中的一种自身保护调节。7血浆sTREM-1浓度可用于临床脓毒症的早期诊断以及评估病情严重程度。8在急性胰腺炎、炎性肠病、类风湿关节炎中，血清sTREM-1浓度均不同程度升高。9中性粒细胞和单核细胞表面TREM-1表达在炎症反应中升高或降低与感染的类型、疾病的炎症严重程度及病程有关。10，11本次调查发现，点滴状银屑病患者血清sTREM-1升高，中间型单核细胞TREM-1表达明显下降，说明中间型单核细胞TREM-1参与炎症反应。

ASO是诊断链球菌感染的敏感指标。较多研究表明，12点滴状银屑病与细菌感染有关，最常见的细菌包括葡萄球菌和链球菌等，机体其他部位的感染，如扁桃体、肠道、牙周炎也会诱发银屑病。中间型单核细胞在感染性疾病和多种自身免疫性疾病过程中发挥重要作用，包括败血症、类风湿关节炎（RA）、多发性硬化症、1型糖尿病等。13，14本次研究证实，点滴状银屑病患者外周血中间型单核细胞比例与ASO浓度正相关。

本次研究还发现，点滴状银屑病患者外周血中间型单核细胞比例与PASI评分正相关，Fujisawa等6用吸附法去除中间型单核细胞可明显改善患者临床症状。在银屑病鼠模型中用白细胞毒素（LtxA）促进中间型单核细胞凋亡具有显著的治疗作用。15因此，通过调控单核细胞凋亡或向非炎性单核细胞极化可能是治疗点滴状银屑病的新策略。有研究表明，TREM-1活化可调节巨噬细胞向促炎型（M1）极化，16用TREM -1活化性抗体活化单核细胞TREM-1，可诱导单核细胞分化为不成熟DC（iDC），导致T细胞增殖。17但TREM-1在单核细胞向中间型极化过程中的作用有待于进一步研究。

综上所述，点滴状银屑病患者外周血中间型单核细胞比例升高，并与PASI具有相关性，其在银屑病病情和疗效评估中的作用需进一步采用大样本验证。单核细胞TREM-1参与点滴状银屑病发病过程，导致TREM-1活化的机制也需进一步研究。调控外周血单核细胞极化及其TREM-1表达可能是治疗点滴状银屑病的新途径。

1王刚.银屑病研究热点.中华皮肤科杂志，2013，46（3）：153-156.

2Rogacev KS，Seiler S，Zawada AM，etal.CD14（++）CD16（+）monocytes and cardiovascular outcome in patients with chronic kidney disease.Eur Heart J，2011，32（1）：84-92.

3Qian L，Weng XW，Chen W，et al.TREM-1 as a potential therapeutic target in neonatal sepsis.Int JClin Exp Med，2014，7（7）：1650-1658.

4 van de Kerkhof PC.The psoriasis area and severity index and alternative approaches for the assessment of severity：persisting areas of confusion.Br JDermatol，1997，137（4）：661-662.

5Wong KL，Tai JJ，Wong WC，et al.Gene expression profiling reveals the defining features of the classical，intermediate，and nonclassical human monocyte subsets.Blood，2011，118（5）：e16 -31.

6 Fujisawa T，Murase K，Kanoh H，et al.Adsorptive depletion ofCD14+CD16+proinflammatory monocyte phenotype in patients with generalized pustular psoriasis：clinical efficacy and effects on cytokines.Ther Apher Dial，2012，16（5）：436-444.

7 Jiyong J，Tiancha H，Wei C，et al.Diagnostic value of the soluble triggering receptor expressed on myeloid cells-1 in bacterial infection：a meta-analysis.Intensive Care Medicine，2009，35（4）：587-595.

8 Jeong SJ，Song YG，Kim CO，et al.Measurement of plasma sTREM-1 in patientswith severe sepsis receiving early goal-directed therapy and evaluation of its usefulness.Shock，2012，37（6）：574-578.

9 Kim TH，Choi SJ，Lee YH，et al.Soluble triggering receptor expressed on myeloid cells-1 as a new therapeutic molecule in rheumatoid arthritis.Med Hypotheses，2012，78（2）：270-272.

10 Poukoulidou T，Spyridaki A，Mihailidou，et al.TREM-1 expression on neutrophils and monocytes of septic patients：relation to the underlying infection and the implicated pathogen. BMC Infect Dis，2011，11（10）：309-319.

11Marioli A，KoupetoriM，Raftogiannis M，et al.Early changes of the kinetics ofmonocyte trem-1 reflect final outcome in human sepsis.BMC Immunol，2014，15（10）：585-596.

12 Fry L，Baker BS，Powles AV，et al.Is chronic plaque psoriasis triggered by microbiota in the skin？Br J Dermatol，2013，169（1）：47-52.

13 Pul R，Morbiducci F，Skuljec J，et al.Glatiramer acetate increases phagocytic activity of human monocytes in vitro and in multiple sclerosis patients.PLos One，2012，7（12）：e51867.

14 Rossol M，Kraus S，Pierer M，et al.The CDl4（bright）CDl6+ monocyte subset is expanded in rheumatoid arthriIis and promotes expansion of the Thl7 cell population.Anhritis Rheum，2012，64（3）：671-677.

15Batycka-Baran A，Maj J，Wolf R，et al.The new insight into the role of antimicrobial proteins-alarmins in the immunopathogenesis of psoriasis.J Immunol Res，2014，2014：628289-628299.

16 Hwang YJ，Jung HJ，Kim MJ，et al.Serum levels of LL-37 and inflammatory cytokines in plaque and guttate psoriasis.Mediators Inflamm，2014，2014：268257-268267.

17 Stenderup K，Rosada C，Dam TN，et al.Resolution of psoriasis by a leukocyte-targeting bacterial protein in a humanized mousemodel.J Invest Dermatol，2011，131（10）：2033-2039.

18 Lo TH，Tseng KY，TsaoWS，etal.TREM-1 regulatesmacrophage polarization in ureteral obstruction.Kidney Int，2014，86（6）：1174-1186.

18 Bleharski JR，KiesslerV，Buonsanti C，et al.A role for triggering receptor expressed on myeloid cells-1in host defense during the early induced and adaptive phases of the immune response.J Immunol，2003，170（7）：3812-3818.

（收稿：2015-03-02 修回：2015-05-15）

·临床研究·

Expression of TREM-1 and intermediatemonocytes in patientsw ith psoriasis guttata

QIAN Qing，BAI Yan-ping，CAO Yong-tong，et al.Department of Dermatology，Peking Hepingli Hospital，Beijing，P.R.China，100013

Objective：To detect the levelof TREM-1 and intermediatemonocytes in the patientswith psoriasis guttata，in order to determine TREM-1's role in the pathogenesis process of psoriasis guttata.M ethods：The peripheral blood was collected from 28 patients and 24 healthy controls.The percentage of intermediate monocytes and TREM-1 expression were analyzed through flow cytometry.The level of sTREM-1 in serum was detected by ELISA.The correlation between intermediatemonocytes，the levels of PASIand ASOwere assessed.Results：The percentage of intermediatemonocytes and the level of sTREM-1 in patientswere 13.5± 4.8%and 277.8 pg/mL，which was higher than those of healthy controls（3.4±1.1%，162.6 pg/mL），with significantly differences（P＜0.05）.The positivity rate of TREM-1 in intermediatemonocytes（80.4±6.8%）and the fluorescence intensity of TREM-1（24.8±7.2）were lower than those of healthy controls（95.6±5.7% and 35.3±5.1）（P＜0.05）.There was positive correlation between the percentage of intermediate monocytes and the levels of PASIand ASO（P＜0.05）.Conclusion：TREM-1 and intermediate monocytesmay be involved in the progress of the disease.

triggering receptor expressed on myeloid cells-1；intermediatemonocytes；psoriasis guttata

北京市东城区科技计划项目（编号：2014-4-005）

1北京市和平里医院，北京，100013

2北京市中日友好医院，北京，100029