生殖器丘疹样棘层松解性皮病ATP2C1基因突变检测

肖学敏 张国毅 王宝玺 贾苇雪 毛秋霞 李诚让

·论著·

生殖器丘疹样棘层松解性皮病ATP2C1基因突变检测

肖学敏 张国毅 王宝玺 贾苇雪 毛秋霞 李诚让*

目的： 检测1例散发性生殖器丘疹样棘层松解性皮病患者ATP2C1基因突变。方法： 提取患者、其父母及100名无亲缘关系健康对照的外周血以及患者皮损组织DNA，PCR扩增ATP2C1基因28个外显子和侧翼序列，并进行测序。结果： 检测到患者血样及皮损组织DNA均存在ATP2C1基因第1570位碱基发生突变T→C，父母及对照未发现突变。结论： ATP2C1基因17号外显子的突变可能是本患者的发病原因。生殖器丘疹样棘层松解性皮病可能与Hailey病组成一个连续病谱。

棘层松解性皮病； 家族性良性慢性天疱疮； ATP2C1基因

1972年，Ackerman1首先报道一组临床表现多样，但具有特征性组织学结构即局灶性皮肤棘层松解伴角化不良的疾病，称为“局灶性皮肤棘层松解角化不良（focal acantholytic dyskeratosis，FAD）”。1984年，Chorzelski等2报道首例局限于女阴的丘疹样棘层松解角化不良，并认为这是一种独立疾病。随后，Cooper3也报道了6例类似女性患者，将其命名为“生殖器丘疹样棘层松解性皮病（papular acantholytic dermatosis of the vulvocrural areas，PAD）”并得到学术界广泛接受。近来，本病与家族性慢性良性天疱疮即Hailey-Hailey病（Hailey-Hailey disease，HHD）的关系日益受到学者的关注，有人检测到PAD是与HHD相同致病基因-ATP2C1基因突变导致的皮肤病。4我们对1例散发PAD患者进行ATP2C1基因突变筛查，并探讨PAD与HHD的关系及其实质。

1　资料和方法

1.1临床资料 先证者，男，48岁，汉族。以外阴瘙痒性丘疹、结节3个月为主诉来我院就诊。3个月前无明显诱因上述部位出现皮色丘疹、结节，呈散在、孤立分布，渐增多，自觉明显瘙痒，搔抓后个别皮疹可脱落。1个月前来我院就诊，诊断“尖锐湿疣”，予“氯雷他定片”口服、外用“咪喹莫特乳膏”等治疗，自觉不耐受，且皮疹数目增加。既往体健，否认不洁性生活史，家族中无类似患者。体格检查：生命体征平稳，心、肺、腹检查无明显异常。皮肤科检查：阴茎及阴囊见多发性圆顶绿豆至黄豆大肤色丘疹、结节，质地稍硬，孤立、散在或群集分布，颈、项、腋窝等处未见皮疹（图1）。实验室检查：血、尿常规、肝、肾功能、血脂基本正常。血HIV（1+2）抗体、RPR及TPPA均（-），皮损处未检测到HPV6、HPV11、HPV16、HPV18等四型HPV的DNA。阴囊处丘疹组织病理示：皮损隆起于皮面，角化过度，棘层增生肥厚，表皮中下部见多处棘刺松解性裂隙和小水疱形成，疱内见棘层松解细胞，部分区域为不完全的棘刺松解，真皮浅层以淋巴细胞为主的浸润（图2a、b）。直接免疫荧光检查示IgG、IgM、IgA、C3阴性。诊断：生殖器丘疹样棘层松解性皮病。治疗：由于该患者肝、肾功能、血脂正常，故给予维胺酯胶囊50 mg，日3次，左西替利嗪片5 mg，日1次口服，配合外用药对症处理。3周后复诊皮疹大部消退，瘙痒明显减轻。随后，继续原方案治疗，2周后电话随访诉皮疹全部消退，仅留色素沉着，随访1年皮疹无复发。

图1　阴茎及阴囊见多发性圆顶绿豆至黄豆大肤色丘疹、结节，质地稍硬，孤立、散在或群集分布（如箭头所示） 图2 皮损隆起于皮面，角化过度，棘层增生肥厚，表皮中下部见多处棘刺松解性裂隙和小水疱形成，疱内见棘层松解细胞，部分区域为不完全的棘刺松解，真皮浅层以淋巴细胞为主的浸润（HE，×40、×100）

1.2方法 外周血及皮损DNA的提取：获得知情同意后，收集患者及其双亲的外周血2 m L，EDTA-K2抗凝，采用美国Promega公司DNA提取试剂盒提取基因组DNA。同时提取100个与家系无血缘关系且健康的正常成人的基因组DNA作为对照。取患者皮损组织标本，用4%甲醛液固定，常规脱水，石蜡包埋，切取3μm薄片，采用酚一氯仿方法提取DNA。

PCR扩增和直接测序：根据已知ATP2C1基因序列，参考文献报道，5对其所有28个外显子及侧翼内含子序列使用在线Primer 5.0程序设计出对应的引物。PCR反应条件为95℃热启动2 min，95℃变性45 s、57℃复性45 s、72℃延伸1min，35个循环。1.5%琼脂糖凝胶电泳检查PCR产物。PCR扩增的目的片段经回收、PCR纯化试剂盒（上海Qiagen公司）纯化、ABI3730自动测序仪（美国Foster City，公司）进行核苷酸序列测定。测序结果与人基因组ATP2C1序列比较。使用 Phred-Phrap-Consed软件包（version 12.0）进行分析。

2　结果

对患者血样及皮损第17对引物的PCR产物测序后发现，患者ATP2C1基因第17号外显子含有杂合性错义突变：第1570位碱基胸腺嘧啶突变为胞嘧啶，即c.1570T＞C（图3a、b），对应密码子TGT变成CGT，导致第524位的中性半胱氨酸残基被碱性精氨酸残基酸替代，即p.C524R（ATP2C1 GenBank NM_ 001199180.1 and NP_001186109.1）。患者的双亲及正常对照均未发现有此突变（图3c）。

3 讨论

图3　ATP2C1基因测序结果

临床上PAD以多发散在或群集，直径0.1～0.5 cm的白色或肤色，质地偏硬的光滑丘疹为特征，可伴不同程度瘙痒。PAD罕见，目前世界上仅报道20例左右，多数为女性，好发于外阴、会阴及肛周，亦可累及股上部及腹股沟。除近来报道1例家族发病外，其余病例均为散发。4PAD组织病理学表现为角化过度、角化不全、棘层松解伴不同程度的角化不良，可见圆体和谷粒细胞。除1例皮损表皮细胞间IgG和C3沉积外，直接免疫荧光检查均无免疫球蛋白和补体沉积，故可排除免疫性大疱病，例如累及外阴的增殖性天疱疮。6男性发病少，文献中只有6例报道，可累及阴囊、阴茎、股上部、肛周及肛管内。7

PAD发病机制尚不明，应与其他外阴丘疹性疾病鉴别。某些良性疾病（如扁平苔藓、汗管瘤和病毒疣等）及生殖器癌可以表现为类似的皮损，但PAD棘层松解性角化不良的组织学特点可排除上述疾病。然而FAD并不是一种疾病所特有的，相似的临床病理学特点可见于一些皮肤病。局限性或节段性的Darier's病临床表现为伴油腻性结痂的棕灰色角化性丘疹及斑块，无发生于生殖器的报道；一般有家族史，由ATP2A2基因突变所致；组织病理上角化过度更明显，无类似PAD的广泛棘层松解。7Grover's病可出现类似PAD的临床病理学表现，然而Grover's病好发于颈部、躯干及四肢近端，亦无发病于肛门生殖器的病例报道。PAD的临床特点与疣状角化不良瘤不同，后者常表现为孤立的丘疹或结节，中央有脐凹，好发于日光暴露部位如头颈部。

本病最容易与HHD相混淆。局限于外阴的HHD文献也有报道，但局限于外阴的HHD有典型HHD的特征性临床表现，即松弛性水疱、糜烂和结痂，且均有家族史，组织病理上无角化不良。8然而，近来报道3例PAD患者在ATP2C1基因上发生突变，且有PAD多年后转变为典型HHD的报道，提示PAD与HHD可能属于同一病谱。4，9本研究中，我们对一散发PAD患者进行ATP2C1基因进行突变筛查，发现该患者存在单核苷酸碱基置换c.1570T＞C，这使得中性半胱氨酸残基改变为碱性精氨酸残基酸，即TGT（Cys）-CGT（Arg）：C524R。患者的双亲以及正常对照均未发现有此突变，查询美国国家生物技术信息中心（NCBI）网站单核苷酸多态性（SNP）数据库也未发现此突变，从而证实了检测到的突变是特异性的突变，非核苷酸多态性，与本患者发病有关。该突变为人类基因突变数据库（HGMD）未记载的、新生的错义致病突变。

ATP2C1基因编码一种叫hSPCA1的钙调磷酸酶，该酶主要定位于角质形成细胞的高尔基体，能将钙离子从胞质泵入高尔基体，调控细胞的正常生理功能。Fairclough等10发现尽管hSPCA1蛋白mRNA水平正常并能正确地结合高尔基体，ATP2C1基因错义突变L341P，C344Y，C411R，T570I，and G789R可导致角质形成细胞hSPCA1蛋白低表达，表明突变后的hSPCA1蛋白结构不稳定或出现了异常折叠。不稳定的hSPCA1蛋白降解速度较野生型蛋白明显加快，丧失了转运功能，使得胞质钙离子异常浓度升高，或高尔基体的钙离子浓度异常降低。钙离子浓度平衡的紊乱会削弱钙离子依赖蛋白包括桥粒芯糖蛋白和桥粒芯胶蛋白的功能，从而影响桥粒的正常结构。桥粒是角质形成细胞间主要的连接结构，桥粒结构受损引起表皮角质形成细胞间黏附障碍，最终导致患处皮肤棘层松解。另外，我们通过GenBank数据库检索该患者突变的相对蛋白位置，发现Cys524在人类、黑猩猩、犬属、牛、小鼠、褐鼠、原鸡、萘对斑马鱼、黑腹果蝇等种属中属于相对保守残基。因此，C524R的错义突变可导致钙离子转运功能异常，进而导致PAD的发病。

PAD目前无特效的疗法。口服及外用糖皮质激素疗效报道不一。除了我们的病例，口服及外用维A酸制剂取得良好疗效亦有报道。9最近，有1例外用0.1%他克莫司软膏成功治疗PAD的报道。4对于难治性病例，可考虑使用物理疗法如电烙、冷冻及激光或手术切除。然而对于许多无症状及轻微病例，确诊后教育患者避免摩擦及各种局部刺激即可，可无需特别治疗。7

综上所述，我们报道了1例罕见的散发男性PAD患者，并首次在国内进行PAD患者的ATP2C1基因突变检测。我们发现了一个新的ATP2C1基因的错义突变c.1570T＞C，并进一步证明了ATP2C1基因是PAD的致病基因。结合PAD和HHD在临床病理及分子遗传学上的相似性，认为生殖器丘疹样棘层松解性皮病可能不是一种独立的疾病，而是与Hailey-Hailey病组成一个共同的连续病谱。

1 Ackerman AB.Focal acantholytic dyskeratosis.Arch Dermatol，1972，106（5）：702-706.

2 Chorzelski TP，Kudejko J，Jablonska S.Is papular acantholytic dyskeratosis of the vulva a new entity？Am J Dermatopathol，1984，6（6）：557-560.

3Cooper PH.Acantholytic dermatosis localized to the vulvocrural area.JCutan Pathol，1989，16（2）：81-84.

4 Pernet C，Bessis D，Savignac M，et al.Genitoperineal papular acantholytic dyskeratosis is allelic to Hailey-Hailey disease.Br J Dermatol，2012，167（1）：210-212.

5 Chao SC，Tsai YM，Yang MH.Mutation analysis of ATP2C1 gene in taiwanese patientswith Hailey-Hailey disease.Br JDermatol，2002，146（4）：595-600.

6Gunes AT，Ilknur T，Pabuccuoglu U，et al.Papular acantholytic dyskeratosis of the anogenital area with positive direct immunofluorescence results.Clin Exp Dermatol，2007，32（3）：301-303.

7 Xiao XM，Xu HX，Xu XL，etal.Papular acantholytic dermatosis of the anogenital areas.Eur JDermatol，2013，23（6）：886-887.

8Wong TY，Mihm MJ.Acantholytic dermatosis localized to genitalia and crural areas ofmale patients：a report of three cases.J Cutan Pathol，1994，21（1）：27-32.

9 Lipoff JB，Mudgil AV，Young S，et al.Acantholytic dermatosis of the crural folds with ATP2C1 mutation is a possible variant of Hailey-Hailey disease.JCutan Med Surg，2009，13（3）：151-154.

10 Fairclough RJ，Dode L，Vanoevelen J，etal.Effect of Hailey-Hailey diseasemutations on the function of a new variantof human secretory pathway Ca2+/Mn2+-ATPase（hSPCA1）.JBiol Chem，2003，278（27）：24721-24730.（收稿：2015-03-15 修回：2015-03-27）

·病例报告·

Analysis of ATP2C1 gene in a patient w ith papular acantholytic dermatosis in genitalia

XIAO Xue-min，ZHANGGuo-yi，WANG Bao-xi，et al.Institute of Dermatology，Chinese Academy of Medical Sciences，Jiangsu Key Laboratory ofMolecular Biology for Skin Diseases and STIs，Nanjing，Jiangsu，210042

Objective：To identify mutation of ATP2C1 gene in a sporadic case with papular acantholytic dermatosis（PAD）in genitalia.M ethods：Genom ic DNA was extracted from the peripheral blood of the patient，parents and 100 healthy controls，aswell as the biopsy specimen of the lesion.All the exons of ATP2C1 gene and the flanking sequenceswere amplified by PCR.Direct sequencingwas performed to screen themutations in the gene.Results：Onemutation（c.1570T＞C）was identified in the patient and none ofmutations was found in the patient's parents and healthy controls.Conclusion：Themutation of ATP2C1 gene is associated with the onset of PAD in this patient，PAD and Hailey-Hailey diseasemay belong to a continnous spectrum.

papular acantholytic dermatosis；Hailey-Hailey disease；ATP2C1 gene

国家自然科学基金（编号：81472872）

协和青年科研基金（编号：33320140048）

中国医学科学院北京协和医学院皮肤病研究所江苏省皮肤病与性病分子生物学重点实验室，南京，210042