气管炎丸的质量标准研究
2015-10-30北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂100079武琳杨光黄菲
北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂(100079)武琳 杨光 黄菲
气管炎丸具有散寒镇咳,祛痰定喘的作用,用于外感风寒引起的气管炎发炎、肺热咳嗽、气促哮喘、喉中发痒、痰涎壅盛、胸膈满闷、老年痰喘等具有较好的疗效。本品收载于《中华人民共和国卫生部药品标准》第四册[1],由黄芩、五味子(醋炙)、青黛等三十味药材组成,而原标准中只收载了显微鉴别,不利于对药品质量可控性。为了更好地控制气管炎丸质量,本次研究通过建立五味子、青黛的薄层鉴别方法和黄芩的含量测定方法,完善了气管炎丸的质量标准,提高了气管炎丸的可控性。
1 仪器与试剂
1.1 仪器 Agilent 1100高效液相色谱仪(DAD二极管阵列检测器),天平型号METTLER TOLEDO XP205型电子分析天平(梅特勒-托利多国际股份有限公司),CAMAG REPROSTAR3数码成像系统(瑞士CAMAG),KQ-250DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司,功率250 W,频率40 kHz)。
1.2 试剂 五味子甲素对照品(供含量测定用110764- 200107)、青黛对照药材(1170-200001)、黄芩苷对照品(供含量测定用110715-200514),对照品及对照药材均购自中国药品生物制品检定所;气管炎丸(北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂,批号6080771、6080767、6080768);Merck薄层板TLC Silica gel 60和Merck薄层板TLC Silica gel 60F254(德国Merck默克公司);配制标准溶液及供试品溶液的试剂均为分析纯,液相色谱用试剂为高效液相级试剂,液相用水为超纯水。
2 方法与结果
2.1 薄层鉴别
2.1.1 五味子 取供试品5g,研细,加二氯甲烷25ml,超声处理20分钟,滤过,滤液蒸干,残渣加甲醇 2ml充分振摇,滤过,滤液作为供试品溶液。取不含五味子药材的阴性样品5g,同法制成阴性对照溶液。另取五味子甲素对照品,加二氯甲烷制成每1ml含0.5mg的溶液,作为对照品溶液。照薄层色谱法[2010年版《中华人民共和国药典》(一部)附录Ⅵ B]试验,吸取供试品溶液和阴性对照溶液各10μl,对照品溶液2μl,分别点于同一硅胶GF254薄层板上,以石油醚(30~60℃)-甲酸乙酯-甲酸(15∶7∶1) 的上层溶液为展开剂,展开,取出,晾干,再展开一次,取出,晾干,置紫外灯(254nm)下检视。供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点,且阴性对照无干扰,见附图1。
附图1 五味子薄层色谱图
2.1.2 青黛 取“2.1.1”项下供试品溶液作为供试品溶液。取不含青黛药材的阴性样品5g,同法制成阴性对照溶液。另取青黛对照药材50mg,加二氯甲烷5ml,充分搅拌,滤过,滤液作为对照药材溶液。照薄层色谱法[2010年版《中华人民共和国药典》(一部)附录Ⅵ B]试验,吸取供试品溶液和阴性对照溶液各20μl,对照药材溶液10μl ,分别点于同一硅胶G薄层板上,以甲苯-二氯甲烷-丙酮(4∶3∶1)为展开剂,展开,取出,晾干。供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同的蓝色和浅紫色的斑点,且阴性对照无干扰,见附图2。
附图2 青黛薄层色谱图
2.2 含量测定
2.2.1 色谱条件 色谱柱为Zorbax SBC18(4.6×150mm, 5μm);流动相为甲醇:0.04%磷酸 (40∶60);流量0.8mL·min-1;检测波长280 nm;柱温30℃。理论板数按黄芩苷峰计算应不低于2500。
图3 气管炎丸中黄芩苷高效液相色谱图
2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取黄芩苷对照品适量,加70%乙醇制成每1ml含25μg的溶液,即得。
2.2.3 供试品溶液的制备 取本品适量,研成细粉,取约0.5g,精密称定,置50ml量瓶中,加入70%乙醇45ml,超声处理(功率250W,频率40kHz)50min,放冷,再加70%乙醇稀释至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
2.2.4 阴性对照溶液的制备 按处方比例取不含黄芩药材的其余药材,按其工艺制成空白制剂,按“2.2.3”项下方法制备,即得。
2.2.5 空白干扰试验 精密吸取供试品溶液、对照品溶液、阴性对照溶液各5μL,在上述色谱条件下进样,记录色谱图。结果黄芩苷可与其他成分基线分离,阴性对照溶液在与黄芩苷对照品相同保留时间处未显色谱峰,故认为空白无干扰。色谱图见附图3。
2.2.6 线性关系考察 分别精密吸取黄芩苷对照品溶液(0.13136mg/ml)0.2μl,0.5μl,1μl,2μl,3μl,4μl,5μl注入液相色谱仪,测定峰面积,以对照品的进样量(μg)为横坐标,以峰面积为纵坐标,结果表明黄芩苷在0.026272μg ~0.6568μg范围内进样量与峰面积呈良好的线性关系,回归方程为Y=3466.60567x-3.84811,r=0.99999,可用外标一点法计算。
2.2.7 精密度试验 精密吸取同一供试品溶液,连续进样6次,测得黄芩苷含量的平均值为1.5539mg·g-1,RSD=0.71%,表明精密度良好。
2.2.8 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液,分别于0,2,4,6,8,12,24h进样测定,测得黄芩苷含量的平均值为1.5195 mg·g-1,RSD值为0.71%,表明供试品溶液在24 h内稳定。
2.2.9 重复性试验 精密称取同一批号(6080771)的样品6份,分别按“2.2.3”项下方法制成供试品溶液,按“2.2.1”项下色谱条件测定,黄芩苷含量的平均值为1.5391mg·g-1,RSD为2.01%。表明本方法重复性良好。
2.2.10 加样回收率试验 精密称取已知含量的供试品(批号6080771,含黄芩苷为1.5391 mg/g)6份,每份约0.25 g,分别精密加入黄芩苷对照品溶液(0.3940 mg·mL-1)1 mL,按“2.2.3”项下的方法制备供试品溶液,并按上述色谱条件测定黄芩苷的含量,平均回收率为97.90%(n=6),RSD为1.43%,结果见附表1。
2.2.11 黄芩苷对照品纯度测定 精密称取黄芩苷对照品6mg,置50ml量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,吸取对照品溶液5μl注入液相色谱仪中,归一化法测定含量, 黄芩苷含量为99.72%
2.2.12 样品含量测定 取3批样品,按“2.2.3”项下的方法制成供试品溶液,每批样品测定3次,结果见附表2。
附表1 黄芩苷加样回收率试验
附表2 样品含量测定结果(n=3)
3 讨论
3.1 本研究增订了五味子和青黛的薄层色谱鉴别方法,在薄层鉴别供试品制备时,二者供试品处理方法一致,增加了该法的实用性,降低了检验成本,有利于以后的生产检验工作。青黛的特征鉴别方法参考了2010年版《中国华人民共和国药典》(一部)青黛项下收载方法[2],将展开剂中的三氯甲烷换成了毒性更低的二氯甲烷,降低了展开剂的毒性,所得青黛斑点清晰,同法制备的阴性对照无干扰,经样品、阴性对照试验,确认该方法可行。分别考察了不同温度和不同湿度条件对分离效果的影响,结果表明在不同温湿度下,五味子和青黛所得主斑点清晰,且阴性无干扰,该法具有良好的耐用性。
3.2 在确定含量测定的供试品溶液制备中,比较了回流提取和超声提取方式,结果发现超声提取效果较好。通过对不同溶剂(甲醇、50%甲醇、70%乙醇、95%乙醇)超声提取对黄芩苷提取率的影响,结果表明70%乙醇超声提取,所得黄芩苷的提取率最高,故选用70%乙醇超声提取。通过比较了超声提取不同时间(30 min、40 min、50 min 、60min)对黄芩苷的提取率影响,结果表明提取50 min时,已基本提取完全,故确定提取时间为50 min。
本研究比较了不同流动相甲醇-0.04%磷酸 (40∶60)和甲醇-0.04%磷酸(47∶53),发现用甲醇-0.04%磷酸(40∶60)比甲醇-0.04%磷酸(47∶53)作为流动相所得黄芩苷峰的峰型好且阴性无干扰,故采用甲醇-0.04%磷酸(40∶60)作为本品含量测定的流动相。
综上所述,本研究增加了五味子、青黛的薄层鉴别方法,建立了高效液相色谱测定气管炎丸黄芩中黄芩苷含量的方法,操作简单、方便,实用。通过本次研究,提高了气管炎丸的质量标准,增加了气管炎丸的可控性。