粘质沙雷氏菌摇瓶发酵产灵菌红素的工艺优化

张丹峰，杨培周，操丽丽，姜绍通*

（合肥工业大学生物与食品工程学院，安徽省农产品精深加工重点实验室，安徽 合肥 230009）

粘质沙雷氏菌摇瓶发酵产灵菌红素的工艺优化

张丹峰，杨培周，操丽丽，姜绍通*

（合肥工业大学生物与食品工程学院，安徽省农产品精深加工重点实验室，安徽 合肥 230009）

为提高灵菌红素产率，本研究通过单因素试验和正交试验优化粘质沙雷氏菌发酵培养基组分和发酵条件，结果表明，最佳培养基配方为：一级大豆油、蛋白胨、NaCl和K2HPO4的添加量分别为4 mL/100 g、1.5%、0.15%和0.15%；最佳发酵条件为：温度30 ℃、接种量1%、装液量70 mL/250 mL三角瓶、振荡培养转速200 r/min，发酵36 h后，灵菌红素的产量最大，为2.98 g/L。粘质沙雷氏菌的胞外脂肪酶活力为15 U/mL。

粘质沙雷氏菌；灵菌红素；单因素试验；正交试验

灵菌红素是由粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）产生的一种次级代谢产物，具有对绿色的反光性的脂溶性色素，易溶于氯仿、甲醇、苯和正己烷等有机溶剂，难溶于水。在酸性条件下呈现红色，碱性条件下呈黄色［1］，具有抗细菌、抗真菌、抗疟疾、免疫抑制和抗肿瘤等功能活性［2-3］。近年来的研究结果表明，该色素对癌细胞具有较强的抑制作用，相比传统的抗癌药物，灵菌红素具有副作用小及针对性强的优点，是极具开发潜力的抗肿瘤药物［4］。

粘质沙雷氏菌能够以甘油、乙醇和油料作物种子粉末等为底物，发酵生产灵菌红素［5］。然而，目前的发酵生产灵菌红素存在的主要问题为：1）底物的纯度，例如甘油等属于化工加工的中间产物，批次间的纯度变化较大，提高作为药品的灵菌红素产品纯度，避免发酵过程的中间污染是其中的重要环节；2）底物的稳定性，例如乙醇等原料属于挥发性，在处理和发酵过程中容易挥发损失，不利于工业化稳定生产［6］；3）菌株代谢，例如油料种子粉末等固体底物与菌株的接触面小，而灵菌红素属于典型的次生代谢产物，容易受到外界环境的影响，以固体为底物不利于菌株稳定表达灵菌红素；4）价格和底物利用率，菌株对挥发性底物等的利用率偏低，增加生产成本，影响灵菌红素的开发价值。因此，开发能够降低发酵成本，提高发酵速率的新型发酵底物，对于深度开发具有抗癌抗肿瘤的新型药物-灵菌红素具有重要意义［7］。已报道的灵菌红素的产率大多为500～2 000 mg/L［8］，为提高灵菌红素的产率，本研究以价格相对较低的一级大豆油为碳源，对粘质沙雷氏菌发酵产灵菌红素的培养基组分和培养条件参数进行优化，确定最佳培养基和发酵培养参数。

1　材料与方法

1.1菌株、培养基与试剂

供试菌株S. marcescens HFUT-1301由合肥工业大学农产品加工研究院提供，已完成对该菌株的形态学观察、生理生化鉴定、16S rDNA鉴定。

基础培养基（g/L）：蛋白胨10、牛肉膏20、NaCl 2、K2HPO42、琼脂18；种子培养基（g/L）：蛋白胨10、酵母膏20、NaCl 2、K2HPO42；发酵培养基（g/L）：蛋白胨10、大豆油30、NaCl 2、K2HPO42。

一级大豆油 益海嘉里安徽粮油工业有限公司；95%乙醇、NaCl、NaOH、K2HPO4（分析纯）、甲醇（色谱纯） 无锡市展望化工试剂公司；牛肉膏、蛋白胨（分析纯） 北京奥博星公司。

1.2仪器与设备

AL104电子天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；TU-1901双光束紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；SW-CJ-1F单人双面净化工作台 苏州净化设备有限公司；HZQ-F160恒温振荡培养箱 哈尔滨市东联电子技术开发有限公司；HC-3018R型高速冷冻离心机 安徽中科中佳科学仪器有限公司。

1.3方法

1.3.1菌种的活化

挑取一定量的固体培养基上的菌落，在基础培养基转接，置于30 ℃的恒温培养箱培养3 d后，置于冰箱中保存备用。

1.3.2种子液的制备

挑取S. marcescens单菌落接入灭菌后冷却后的装有50 mL种子培养基的250 mL三角瓶中，30 ℃、200 r/min在恒温振荡培养箱培养12 h，作为种子液。

1.3.3粘质沙雷氏菌生长曲线的绘制

采用比浊法测定菌体的含量，取适量发酵液进行10 倍稀释，以未接种的培养基做等量稀释作对照，在600 nm波长处测定细胞悬浮液的光密度（OD）值 。在3 个250 mL的三角瓶中分别装50 mL种子培养基，分别加入已活化12 h种子液1 mL，30 ℃、200 r/min培养24 h，每隔1 h测定其OD600nm值，绘制粘质沙雷氏菌的生长曲线［9］。

1.3.4菌体生物量测定

采用比浊法测定生物量。取4 mL发酵一定时间后的发酵液进行10 倍稀释测定细胞悬浮液的OD600nm值，以未接种的培养基作为等量稀释作对照［11］。

1.3.5灵菌红素含量测定

以纯化后的灵菌红素为标准样品［1］，在酸性（pH 3）条件下，测定OD535nm值，以灵菌红素酸性甲醇溶液质量浓度为横坐标，OD535nm值为纵坐标，绘制标准曲线，得到回归方程为y=1.856 0x-0.013 4（R2=0.999 8），表明OD535nm值和灵菌红素质量浓度线性关系明显［10-11］。

采用比色法测定，通过测定稀释一定倍数的浸提液的OD535nm值，比较各溶液中的灵菌红素含量。

1.3.6粘质沙雷氏菌发酵培养基和培养条件的优化

1.3.6.1大豆油添加量对灵菌红素和菌体生长的影响

在初始发酵培养基的基础上，分别添加2.5、3、3.5、4、4.5 mL/100 g的大豆油，每个梯度做3 组平行。装液量为100 mL/250 mL三角瓶，按2%的接种量接入对数期的种子液，置于30 ℃、200 r/min的恒温振荡培养箱中培养36 h。测定发酵所产灵菌红素含量和菌体生物量。

1.3.6.2蛋白胨添加量对灵菌红素和菌体生长的影响

在初始发酵培养基和已优化的单因素的基础上，分别添加0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%的蛋白胨，每个梯度做3 组平行。装液量为100 mL/250 mL三角瓶，按2%的接种量接入对数期的种子液，置于30 ℃、200 r/min的恒温振荡培养箱中培养36 h。测定发酵所产灵菌红素含量和菌体生物量。

1.3.6.3NaCl添加量对灵菌红素和菌体生长的影响

在初始发酵培养基和已优化的单因素的基础上，分别添加0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%的NaCl，每个梯度做3 组平行。装液量为100 mL/250 mL三角瓶，按2%的接种量接入对数期的种子液，置于30 ℃、200 r/min的恒温振荡培养箱中培养36 h。测定发酵所产灵菌红素含量和菌体生物量。

1.3.6.4K2HPO4添加量对灵菌红素和菌体生长的影响

在初始发酵培养基和已优化的单因素的基础上，分别添加0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%的K2HPO4，每个梯度浓度做3 组平行。装液量为100 mL/250 mL三角瓶，按2%的接种量接入对数期的种子液，置于30 ℃、200 r/min的恒温振荡培养箱中培养36 h。测定发酵所产灵菌红素含量和菌体生物量。

1.3.6.5培养温度对灵菌红素和菌体生长的影响

在初始发酵培养基和已优化的单因素的基础上，分别设置24、26、28、30、32 ℃的培养温度，每种温度梯度做3 组平行。装液量为100 mL/250 mL三角瓶，按2%的接种量接入对数期的种子液，置于200 r/min的恒温振荡培养箱中培养36 h。测定发酵所产灵菌红素含量和菌体生物量。

1.3.6.6接种量对灵菌红素和菌体生长的影响

在初始发酵培养基和已优化的单因素的基础上，分别按接种量0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%对数期的种子液进行接种，每个梯度做3 组平行。装液量为100 mL/250 mL三角瓶，200 r/min的恒温振荡培养箱中培养36 h。测定发酵所产灵菌红素含量和菌体生物量。

1.3.6.7装液量对灵菌红素和菌体生长的影响

在初始发酵培养基和已优化的单因素的基础上，分别设定250 mL三角瓶装液量为50、60、70、80、90 mL，每个梯度做3 组平行。200 r/min的恒温振荡培养箱中培养36 h。测定发酵所产灵菌红素含量和菌体生物量。

1.3.6.8恒温振荡培养箱转速对灵菌红素和菌体生长的影响

在初始发酵培养基和已优化的单因素的基础上，分别设定摇床转速为160、180、200、220、240 r/min，每个梯度做3 组平行。置于恒温振荡培养箱中培养36 h。测定发酵所产灵菌红素含量和菌体生物量。

1.3.6.9正交试验优化

在单因素试验的基础上，以灵菌红素含量为指标，测定已稀释5 倍的浸提液的OD535nm值，选择大豆油添加量、蛋白胨添加量、转速、培养温度为主要影响因素，进行L9（34）正交试验。

1.3.7脂肪酶活力测定

取4 个100 mL的锥形瓶，分别于对照瓶（A）和样品瓶（B-1、B-2、B-3 3组重复实验）中分别加入5.0 mL的聚乙烯醇橄榄油乳化液和4 mL的磷酸缓冲液，置于37 ℃水浴中预热保温10 min，A瓶中加入10 mL 95%的乙醇和1 mL的粗酶液，在B-1、B-2、B-3瓶中分别加入1 mL酶液，塞上瓶塞充分摇动。保温30 min，在B-1、B-2、B-3瓶加入10 mL 95%乙醇终止反应。锥形瓶中加入酚酞指示剂2 滴，用0.05 mol/L NaOH溶液滴定至微红色为终点，记下NaOH消耗体积数。酶活单位定义为在37 ℃条件下，每分钟从橄榄油中释放出1 μmol脂肪酸的酶量为一个脂肪酶活力（U）［12］。

2　结果与分析

2.1粘质沙雷氏菌生长曲线

图1　粘质沙雷氏菌生长曲线Fig.1　Growth curve of Serratia marcescens

细菌的菌龄对其增殖代谢具有重要的影响，必须选择菌龄处于对数期的种子液进行发酵，由图1可知，0～5 h为适应期，6～15 h为对数期，16～18 h为稳定期，19 h后进入衰亡期。因此，选择发酵12 h的种子液进行发酵培养，这种菌种中后期活性大，延滞期短，适应性强［9］。

2.2单因素试验

2.2.1大豆油添加量对灵菌红素含量和菌体生长的影响

图2　大豆油添加量对灵菌红素和菌体生长的影响Fig.2　Effect of soybean oil concentration on prodigiosin production and cell growth

由图2可知，在大豆油添加量为3 mL/100 g时，灵菌红素和菌体生物量均达到最大。碳源不足会影响到菌体的生长繁殖代谢，碳源过多，大豆油漂浮在培养液上方阻碍培养基的气体交换，影响菌体的繁殖和发酵产灵菌红素［9］。因此，大豆油的适宜添加量为3 mL/100 g。

2.2.2蛋白胨添加量对灵菌红素含量和菌体生长的影响

图3　蛋白胨添加量对灵菌红素和菌体生长的影响Fig.3　Effect of peptone concentration on prodigiosin production and cell growth

由图3可知，在蛋白胨添加量为1.5%时，灵菌红素含量和菌体生物量均达到最大。氮源影响粘质沙雷氏菌的代谢生产灵菌红素，当氮源过多时，培养基中碳氮比例失调也会对粘质沙雷氏菌的繁殖代谢产生一定影响［9］。因此，氮源适宜添加量为1.5%。

2.2.3NaCl添加量对灵菌红素含量和菌体生长的影响

图4　NaCl添加量对灵菌红素和菌体生长的影响Fig.4　Effect of NaCl concentration on prodigiosin production and cell growth

由图4可知，在NaCl添加量为0.15%时，灵菌红素和菌体生物量达到最大值。钠盐含量过低，会对微生物正常的代谢造成影响，钠盐含量过高，会造成细胞外液渗透压过高，对粘质沙雷氏菌代谢造成影响［9］。因此，NaCl适宜添加量为0.15%。

2.2.4K2HPO4添加量对灵菌红素含量和菌体生长的影响

图5　K 5 K2HPOHPO4添加量对灵菌红素和菌体生长的影响Fig.5　Effect of K2HPO4concentration on prodigiosin production and cell growth

由图5可知，在K2HPO4添加量为0.15%时，灵菌红素含量达到最大值。钾盐含量过低，不能满足微生物正常代谢所需的无机盐，钾盐含量过高，会造成细胞外液渗透压过高，影响沙雷氏菌的正常代谢。因此，K2HPO4适宜添加量为0.15%。

2.2.5培养温度对灵菌红素含量和菌体生长的影响

图6　培养温度对灵菌红素和菌体生长的影响Fig.6　Effect of incubation temperature on prodigiosin production and cell growth

由图6可知，当温度从24～30 ℃之间变化时，灵菌红素的含量和菌体生物量随着温度的升高而增加，当温度超过30 ℃时，灵菌红素的含量和菌体生物量随着温度的降低而减少。因此，粘质沙雷氏菌发酵产灵菌红素的适宜温度为30 ℃。这与已报道的灵菌红素最佳发酵温度28 ℃保持相近［13-15］。

2.2.6接种量对灵菌红素含量和菌体生长的影响

由图7可知，当接种量在1%时，灵菌红素的含量和菌体生物量达到最大值。接种量过小，菌体生长缓慢，延长了发酵周期。接种量过大，菌体增长过快，对营养物质消耗巨多，影响后期灵菌红素的生产［9］。因此，粘质沙雷氏菌发酵产灵菌红素的适宜接种量为1%。

图7　接种量对灵菌红素和菌体生长的影响Fig.7　Effect of inoculum amount on prodigiosin production and cell growth

2.2.7装液量对灵菌红素含量和菌体生长的影响

图8　装液量对灵菌红素和菌体生长的影响Fig.8　Effect of medium volume on prodigiosin production and cell growth

由图8可知，当装液量小于在70 mL/250 mL时，灵菌红素的含量和菌体生物量随着装液量的升高而增加，当接种量超过70 mL/250 mL时，灵菌红素的含量和菌体生物量随着装液量的降低而减少。装液量过小，色素的产率过低。装液量过大，发酵液中溶氧不足，影响到粘质沙雷氏菌的快速增殖，进一步影响后期灵菌红素的生产［9］。因此，粘质沙雷氏菌发酵产灵菌红素的适宜装液量为70 mL/250 mL。

2.2.8摇床转速对灵菌红素含量和菌体生长的影响

图9　摇床转速对灵菌红素含量和菌体生长的影响Fig.9　Effect of shaking speed on prodigiosin production and cell growth

由图9可知，在摇床转速达到220 r/min之前，灵菌红素的含量和菌体生物量随着摇床转速的增加而升高，当转速超过220 r/min时，灵菌红素的含量和菌体生物量随着摇床转速的降低而保持稳定。转速过低，发酵液溶氧不足，菌体生长缓慢，延长了发酵周期［16］。因此，粘质沙雷氏菌发酵产灵菌红素的适宜摇床转速为220 r/min。

2.3正交试验

在单因素试验的基础上，进行L9（34）正交试验。试验因素水平设计及结果如表1所示。由极差分析结果可知，影响因素由大到小依次为：大豆油添加量＞蛋白胨添加量＞转速＞培养温度。主要因素取最佳水平，次要因素考虑实际情况取值，最佳组合为A3B2C1D2。

表1　正交试验设计及结果Table1　Results of orthogonal array design

表2　正交试验方差分析Table2　Analysis of variance of the results of orthogonal array design

方差分析结果如表2所示，大豆油添加量对色素产量影响显著，蛋白胨添加量、转速、培养温度的影响较弱。综合极差分析和方差分析并结合实际情况［17-20］，取最佳发酵条件为：大豆油添加量为4 mL/100 g、蛋白胨添加量1.5%，转速200 r/min、培养温度30 ℃。根据正交试验结果，对最佳发酵条件进行验证，重复3 次实验取平均值，在此最佳工艺条件下灵菌红素产量为2.98 g/L，菌体生物量测定指数OD600nm为1.752。

2.4最佳发酵条件下的脂肪酶活力

表3　最佳发酵条件下的脂肪酶活力Table3　Lipase activity under optimized fermentation conditions

由表3可知，在大豆油添加量为4 mL/100 g、蛋白胨添加量1.5%、转速200 r/min、培养温度30 ℃条件下，发酵液中脂肪酶活力平均值达到15 U/mL，脂肪酶活力较高，说明粘质沙雷氏菌能够快速、高效分解利用大豆油，实现微生物菌体的大量增殖和灵菌红素的快速大量生产［21］。且以一级大豆油为碳源进行发酵产灵菌红素，和国外报道的以工业有机废弃物以及酒精等作为碳源相比，使用大豆油作碳源可以避免重金属离子污染，从源头上保证灵菌红素产品的纯度。

3　结论与讨论

本研究分别以灵菌红素含量和菌体生物量为指标，对以大豆油为碳源发酵产灵菌红素的培养基组分和发酵条件进行单因素和正交试验优化，结果表明，最佳培养基组分添加量为一级大豆油4 mL/100 g、蛋白胨1.5%、NaCl 0.15%、K2HPO40.15%；最佳发酵条件为培养温度30 ℃、接种量1%、装液量70 mL/250 mL、振荡培养转速200 r/min，此时脂肪酶活力达到15 U/mL，灵菌红素产量最高为2.98 g/L。

使灵菌红素的产率在已报道的基础500～2 000 mg/L上提高了0.5 倍，对快速、大量的生产灵菌红素具有重要指导意义。Chen等［22］报道的粘质沙雷氏菌的灵菌红素的产率高于本研究的结果，主要原因在于其采用的菌株S. marcescens C3是S. marcescens CH-1脂肪酰转移酶/乙酰转移酶同源基因（rssC）的突变株，而本研究采用的菌株是S. marcescens野生菌。

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Optimization of Shake Flask Cultivation Conditions for Prodigiosin Production by Serratia marcescen

ZHANG Danfeng， YANG Peizhou， CAO Lili， JIANG Shaotong*
（Key Laboratory for Agricultural Processing of Anhui Province， School of Biotechnology and Food Engineering，Hefei University of Technology， Hefei 230009， China）

This paper reports the optimization of medium components and fermentation conditions for improved production of prodigiosin by Serratia marcescen using single factor and orthogonal array designs. Results indicated that the optimal medium consisted of 4 mL/100 g of soybean oil， 1.5% of peptone， 0.15% of sodium chloride and 0.15% of potassium dihydrogen phosphate， and the optimal fermentation conditions were determined as 30 ℃， an inoculum size of 1%， 70 mL of medium contained in a 250-mL flask， and cultivation with shaking at 200 r/min. The maximum prodigiosin production achieved after 36 h of cultivation under the optimized conditions was 2.98 g/L， and the activity of extracellular lipase from S. marcescens was 15 U/mL.

Serratia marcescens； prodigiosin； single factor method； orthogonal array design

Q939.97

A

1002-6630（2015）13-0119-06

10.7506/spkx1002-6630-201513023

2014-10-05

“十一五”国家科技支撑计划项目（2010BAD01B07）；安徽省自然科学基金项目（1408085MC67）

张丹峰（1988—），男，硕士研究生，研究方向为油脂生物化学。E-mail：zdf19881024@126.com

姜绍通（1954—），男，教授，本科，研究方向为粮食及油脂蛋白工程。E-mail：jstxsgj@163.com