Dermol与E—cadherin在喉鳞状细胞癌组织中的表达及其相关性研究

杨文婧　赵瑞力

[摘要] 目的 探讨喉鳞状细胞癌组织中Dermol与E-cadherin的表达及其相关性。 方法 应用免疫组化SP法检测Dermol与E-cadherin在48例喉鳞癌组织及30例癌旁正常组织中的表达情况，分析它们在不同组织中的相互关系及与喉鳞癌临床参数的关系。 结果 Dermol、E-cadherin在喉鳞癌及癌旁正常组织中的阳性表达率比较，差异均有高度统计学意义（P < 0.01）；不同淋巴结转移及临床分期情况的喉鳞状细胞癌组织中Dermol、E-cadherin的阳性表达率比较，差异均有统计学意义（P < 0.01或P < 0.05）；不同年龄的喉鳞状细胞癌组织中Dermol、E-cadherin的阳性表达率比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。喉鳞状细胞Dermol的阳性表达与E-cadherin的阳性表达呈负相关（r = -0.344，P < 0.05）。 结论 Dermol与E-cadherin在喉鳞状细胞癌发生、分化程度、浸润及转移过程中的起重要作用，Dermol与E-cadherin的协同作用可能影响喉鳞状细胞癌的浸润和转移。

[关键词] 喉鳞状细胞癌；Dermol；E-cadherin；免疫组化

[中图分类号] R739.65 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2015）09（c）-0125-04

[Abstract] Objective To investigate the expression and clinical significances of Dermol and E-cadherin in laryngeal squamous cell carcinoma （LSCC）. Methods The expression of Dermol and E-cadherin was detected by immunohistochemistry SP method in 48 tissues of LSCC and 30 tissues of tumor-adjacent normal. The relationship between two factors and clinical pathological features of LSCC was investigated. Results The differences of the positive rate of Dermol and E-cadherin in tissues of LSCC and tumor-adjacent normal were statistically significant （P < 0.01）； the positive expression rate of Dermol and E-cadherin in different status of lympha node metastasis， clinical stage in LSCC was statistical significant different （P < 0.01 or P < 0.05）； but no statistically significant difference between the different age groups （P > 0.05）. The positive expression of Dermol was negatively related to that of E-cadherin （r = -0.344， P < 0.05）. Conclusion Dermol and E-cadherin play an important role in the occurrence， degree of differentiation， infiltration and metastasis of laryngeal squamous cell carcinoma. The synergistic effect of Dermol and E-cadherin may have some effects on the infiltration and metastasis of laryngeal carcinoma.

[Key words] Laryngeal squamous cell carcinoma； Dermol； E-cadherin； Immunohistochemistry

喉癌是头颈部肿瘤中最为常见的一种，其中又以喉鳞状细胞癌（laryngeal squamous cell carcinoma，LSCC）最为多见，喉鳞状细胞癌具有较高的侵袭能力，发生局部复发和转移的能力较高[1]。虽然喉癌在早期有很高的生存率，但是大多数患者确诊时已到了晚期（Ⅲ-Ⅳ期），从而导致了不良的预后效果。尽管手术技术和放疗技术得到明显改善，但喉鳞状细胞癌的疗效仍不十分理想。探索与喉鳞状细胞癌发生、转移相关的肿瘤因子，对喉鳞状细胞癌的的治疗有着重要的临床指导意义。Dermol也被称为Twist2，属于碱性Helix-loop-helix（b-HLH）蛋白家族的成员。目前的研究发现Dermol蛋白在不同的肿瘤中表达并不相同，它在发育和肿瘤发展过程中的作用及机制尚不十分清楚，有待进一步研究。为了进一步探讨Dermol与E-cadherin在喉鳞状细胞癌发生、发展及侵袭过程中的作用及两者的相关性，本研究采用免疫组化法检测喉鳞状细胞癌组织及癌旁正常组织中Dermol与E-cadherin的表达情况并进行相关性分析。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2010年2月～2013年3月沧州市人民医院（以下简称“我院”）耳鼻喉科的喉鳞状细胞癌手术切除标本及其癌旁正常组织，其中48例喉鳞状细胞癌组织及癌旁正常组织30例。癌旁组织均经病理检查明确为正常组织。所有喉癌患者术前都未行放、化疗，临床资料完整。年龄41～80岁，中位年龄60.2岁；高分化13例，中分化19例，低分化16例；Ⅰ、Ⅱ期（早期）18例，Ⅲ、Ⅳ期（晚期）30例；声门上型17例，声门型31例。本研究已经我院医学伦理委员会批准通过。

1.2 实验方法

1.2.1 主要试剂 Dermol鼠单克隆抗体（Twist2C1a）：sc-81417 Santa Cruz Biotechnology，Inc）；E-cadherin鼠单克隆抗体（ZM-0094北京中衫金桥生物技术有限公司）；鼠二抗免疫组化试剂盒（SP-9002北京中衫金桥生物技术有限公司）；DAB显色液（ZLI-9032北京中杉金桥生物技术有限公司）。

1.2.2 免疫组织化学S-P方法 所选标本均制成石蜡标本，4 μm连续切片，一抗所选浓度Dermol鼠单克隆抗体1∶100，E-catenin鼠抗人单克隆抗体为1∶50。采用免疫组化SP法，严格遵守操作步骤进行实验。设置PBS代替一抗为阴性对照，为质量控制标准，喉癌旁正常组织为正常对照组。

1.3 结果判定

Dermol蛋白阳性着色位于细胞质，出现片状或颗粒状的棕褐色的胞质或胞核细胞为阳性细胞。结果采用半定量记分法判定[2]，首先按阳性着色程度评分，再按阳性细胞所占比例评分，将两者的乘积作为判定结果：4～12分为阳性，<4分为阴性，阳性表达为异质表达。E-catenin染色定位于细胞膜，采用Mattern积分法[3]，将阳性细胞百分率评分和染色强度评分相乘：阳性指数>3为阳性，≤3为阴性。>10%细胞出现胞质和/或核表达为异位表达，异位表达均阴性。

1.4 统计学方法

采用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析，不符合正态分布的改用中位数；计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验；相关性分析用Spearman等级相关分析，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Dermol、E-cadherin在喉鳞癌及癌旁正常组织中的表达

Dermol在喉鳞状细胞癌中的阳性表达率为58.33%（28/48）高于癌旁正常组织黏膜的16.67%（5/30）；E-cadherin在喉鳞状细胞癌中的阳性表达率为22.91%（11/48），低于癌旁正常组织黏膜的100.00%（30/30）（P < 0.01）。见图1、2，表1。

2.2 喉鳞状细胞癌中Dermol、E-cadherin表达与喉鳞癌临床病理参数的关系

Dermol在有淋巴结转移的喉鳞癌组织中的阳性表达率明显高于无淋巴结转移者；E-cadherin在有淋巴结转移的喉鳞癌组织中的阳性表达率明显低于无淋巴结转移者，差异均有高度统计学意义（P < 0.01）。Dermol在Ⅰ、Ⅱ期（早期）喉鳞癌组织中的阳性表达率明显低于Ⅲ、Ⅳ期（晚期）者；E-cadherin在Ⅰ、Ⅱ期（早期）喉鳞癌组织中的阳性表达率明显高于Ⅲ、Ⅳ期（晚期）者，差异均有统计学意义（P < 0.01或P < 0.05）。Dermol在不同病理分化程度的喉鳞癌组织中阳性表达率比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。E-cadherin在高分化鳞状细胞癌中的阳性表达率较高，而在中低分化鳞状细胞癌中未见表达，两者比较差异有统计学意义 （P < 0.05）。Dermol与E-cadherin在声门上型喉癌中的阳性表达率与在声门型喉癌比较，差异均无统计学意义（P > 0.05）。不同年龄喉鳞癌患者喉鳞癌组织中Dermol与E-cadherin阳性表达率比较，差异均无统计学意义（P > 0.05）。见表2。

2.3 Dermol与E-cadherin在喉鳞癌中的相关性

在48例喉癌中，3例癌组织中Dermol、E-cadherin均呈阳性表达，12例癌组织中Dermol、E-cadherin均呈阴性表达。Dermol表达阳性但E-cadherin表达阴性的喉癌组织有25例；E-cadherin表达阳性但Dermol表达阴性的喉癌有8例。经Spearman等级相关分析，两者表达呈负相关（r = -0.344，P < 0.05）。

3 讨论

Dermol是一个高度保守的转录因子，属于螺旋-环-螺旋（bHLH）转录因子家族，在不同的种属之间其核苷酸和氨基酸序列高度保守。Dermol是在使用E12作为引物的一种双酵母杂交体中首次被发现，由于它的表达模式是在老鼠胚胎的dermis（真皮）组织中，所以被称为Dermol[4]。后来由于Dermol与Twist1的高度同源和表达模式的重叠性被命名为Twist2。目前大量的研究已经证实，Twist1可以诱导EMT的发生。Dermol可能与Twist1相似诱导EMT的发生。最近研究发现Dermol异常表达与肿瘤有着密切关系，Dermol与乳腺癌、结肠癌、胃癌、甲状腺癌及肝癌的表达在国内外有相关报道[5-12]，但其在喉鳞状细胞癌中的表达及其意义却鲜有报道。

本研究结果表明：Dermol蛋白表达位于细胞质中，呈棕褐色。48例喉鳞癌组织中阳性表达率（58.33%）明显高于30例癌旁正常组织中阳性表达率（16.67%）（P < 0.01）。在喉鳞癌组织中Dermol蛋白表达与淋巴结转移、临床分期相关（P < 0.05或P < 0.01），而与肿瘤病理学分级、临床分型及年龄无关（P > 0.05）。由此可见，Dermol在喉鳞状细胞癌中高表达，且在淋巴结转移与临床分期具有统计学意义，由此推断Dermol高表达的鳞状细胞癌组织具有更强的侵袭能力，Dermol可能成为判断喉鳞状细胞癌预防或预后的检测指标之一。目前研究发现，在口腔/咽部癌症患者中，Dermol与较高的肿瘤分级和较短的生存率有关，Dermol通过上皮间充质转化、抑制细胞凋亡来助于头颈部鳞状细胞癌的侵袭[13]。

E-catenin是Wnt信号传导通路中重要的调控一员[14]，当肿瘤细胞中E-catenin遇到启动子区域甲基化、转录抑制或基因突变时，其结构功能便会出现异常，细胞的黏附功能出现障碍，导致了肿瘤细胞的侵袭性生长及远处转移[15]。在甲状腺癌[16]、食道癌[17]、胃癌[18]及喉癌[19]中均发现E-catenin表达下调，并与肿瘤的转移及复发有一定相关性。国外曾有研究发现[20]，E-catenin在头颈部鳞癌中表达下调，并与头颈部鳞状细胞癌的血管侵袭性和患者生存率相关。本研究发现，癌旁正常组织中E-catenin表达阳性染色定位于细胞膜，而喉鳞状细胞癌组织中E-catenin表达主要位于细胞质及细胞核中。喉鳞状细胞癌中E-catenin阳性表达明显低于癌旁正常组织，喉鳞状细胞癌的转移、侵袭能力越高，E-catenin的阳性表达率越低，也同样证实了E-catenin与喉鳞状细胞癌的侵袭与转移相关。

喉鳞状细胞癌的发生、侵袭及转移机制相当复杂。通过对EMT机制研究发现，Dermol形成Twist1/Twist2/Mi2/NuRD蛋白复合物，其与E-box的启动子结合，下调E-cadherin的表达，导致了EMT的发生，这同样可能是喉鳞状细胞癌侵袭和转移的途径之一。本研究结果同时显示：Dermol的表达率越高，E-catenin的表达率越低，喉鳞癌的侵袭、转移能力越强，Dermol蛋白表达与E-catenin的表达呈明显负相关（r = -0.344，P = 0.034）。由此可推测：Dermol的过度表达可能引起了E-cadherin表达的下调，两者协同促进了EMT的发生，导致了喉鳞状细胞癌的发生和侵袭。同时检测喉鳞状细胞癌中Dermol和E-catenin的表达可能有助于对肿瘤进展风险性的分级。此次研究尚未涉及喉鳞状细胞癌患者的预后及5年生存率，Dermol在喉鳞状细胞癌中的调控机制及与患者预后及生存率的关系有待进一步研究。

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（收稿日期：2015-04-24 本文编辑：任 念）