清营汤对大鼠体内非那西汀与咪达唑仑药动学的影响

杨 林，胡 秀，宫 丽，龙 坤，兰 艳，王雨来

（1. 黄石市中心医院（湖北理工学院附属医院）药学部，湖北 黄石 435000；2. 肾脏疾病发生与干预湖北省重点实验室，湖北 黄石 435000）

清营汤对大鼠体内非那西汀与咪达唑仑药动学的影响

杨 林1，2，胡 秀1，2，宫 丽1，2，龙 坤1，2，兰 艳1，2，王雨来1，2

（1. 黄石市中心医院（湖北理工学院附属医院）药学部，湖北 黄石 435000；2. 肾脏疾病发生与干预湖北省重点实验室，湖北 黄石 435000）

考察清营汤对非那西丁和咪达唑仑在大鼠体内药代动力学的影响，进而探讨清营汤对CYP1A2和CYP3A1酶活性的影响。将大鼠随机分为空白对照组和清营汤组，清营汤组大鼠连续给药10 d，空白对照组大鼠给予相同体积生理盐水。第11 d，大鼠分别静脉注射非那西丁和咪达唑仑，高效液相色谱法分别测定非那西丁和咪达唑仑的血药浓度，DAS2.0软件计算药动学参数。结果清营汤组大鼠体内的非那西丁药代动力学参数较正常对照组出现显著差异，代谢速率加快；但是清营汤对咪达唑仑在大鼠的药代动力学特征没有显著影响。实验清营汤可能诱导大鼠体内的CYP1A2活性，但是对CYP3A1没有显著影响。

清营汤；CYP1A2；CYP3A1；非那西丁；咪达唑仑

清营汤是治疗温病热邪入营分的经典方。最早在《临证指南医案》中，叶天士选用玄参、丹参、竹叶心、犀角、生地、连翘等药治疗温病热入营分，效果较为显著。在清代著名温病学家吴鞠通的《温病条辨》中，其根据叶氏的方药组方总结归纳，整理命名为清营汤。该方由生地、连翘、玄参、竹叶、麦冬、黄连、丹参、犀角、银花组成，具有清营养阴、透热转气、清心安神和活血化疲等多种功能［1，2］。

清营汤证之病机为热邪入营，营分证的基本病机是温邪入营，灼伤营阴，心神被扰。该经典方养阴不留邪，祛邪不伤正，视为治热伤营阴证候的代表方［3，4］。我院多采用其辅助治疗各类病症的发热。随着清营汤临床应用的增加，了解其安全性特别是与其它药物联合应用时的安全性，即药物之间的相互作用的要求也越来越迫切。

本研究采用大鼠细胞色素 P450 CYP1A2和CYP3A1的特异性探针底物非那西丁（CYP1A2）和咪达唑仑（CYP3A1）对大鼠体内的 CYP1A2和CYP3A1活性改变进行研究［5］。大鼠预先连续灌胃清营汤进行预处理，然后分别考察非那西丁和咪达唑仑在大鼠体内的药代动力学特征的改变，来判断CYP1A2和CYP3A1活性的变化。本研究结果对清营汤的临床应用具有参考价值。

1 实验部分

1.1 动物

普通级雄性SD大鼠，体重180～220 g，由北京维通利华动物实验中心提供，实验动物合格证号为SCXK（京）2010-0016。

1.2 药品与试剂

清营汤由本院药学部自制，经浓缩成1 g生药/1 mL水煎剂的浓度。非那西丁、咪达唑仑（美国Sigma公司）；乙腈、甲醇（色谱纯，美国Fisher Scientific公司）；磷酸二氢钾（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；水为纯净水。

1.3 仪器

日立 L-7000型高效液相色谱系统，配有L-7110 型泵，L-7200 型自动进样器，L-7420 型UV检测器；DCY-24S水浴式氮吹仪（青岛海科仪器有限公司）；Sigma 3K15 高速低温离心机（Sigma公司）；XW-80A 旋涡混合器（上海青浦沪西仪器厂）；BS110S型电子天平（赛多利斯科学仪器（北京）有限公司）；KQ 500DE型数控超声波清洁器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.4 方法

1.4.1 色谱条件

采用前期已经验证的色谱方法，具体条件如下：

非那西丁：色谱柱为Aglient ZORBAX SB-C18柱（4.6×250 mm，5 µm）；流动相：10 mm 磷酸氢二钾溶液—甲醇（体积比55∶45）；检测波长为254 nm；柱温为30 ℃；流速为1.0 mL/min。

咪达唑仑：色谱柱为Aglient ZORBAX SB-C18柱（4.6×250 mm，5 µm）；流动相：水—乙腈（体积比50∶50）；检测波长为225 nm；柱温为30 ℃；流速为1.0 mL/min。

1.4.2 血浆样品处理

取血浆样品200 µL，加入沉淀剂（乙腈：甲醇1∶1，含内标）600 µL，充分涡旋振荡1 min，14 000 r/min离心5 min，取上清500 µL置1.5 mL离心管中，氮气吹干，取100 µL甲醇复溶，进样40 µL进行分析。

1.4.3 大鼠分组及预处理

20只大鼠随机分为空白对照组和清营汤组，每组 10只。清营汤组的大鼠每只每次灌胃清营汤 2 mL，每天早晚各一次，连续给药10 d。空白对照组大鼠给予同体积生理盐水。在第11 d进行非那西丁和咪达唑仑的药代动力学实验，空白对照组和清营汤组大鼠再分别随机分为两组，每组5只，分别给予非那西丁和咪达唑仑。

1.4.4 非那西丁大鼠药动学实验方法［6，7］

将5只空白对照组大鼠和5只清营汤组大鼠按照5 mg/kg剂量静脉注射非那西丁。分别于0、0.033、0.083、0.167、0.333、0.5、1、1.5和2 h眼球静脉丛取血0.3 mL。3 000 r/min离心15 min，取血浆-30℃保存备用。

1.4.5 咪达唑仑大鼠药动学实验方法［8-11］

将另外5只空白对照组大鼠和5只清营汤组大鼠按照5 mg/kg剂量静脉注射咪达唑仑。分别于0、0.033、0.083、0.167、0.333、0.5、1、1.5和2 h眼球静脉丛取血0.3 mL。3 000 r/min离心15 min，取血浆-30 ℃保存备用。

1.4.6 数据处理

数据统计分析采用SPSS 18.0软件，计数资料以mean ± SD表示，采用t 检验方法，数据组间比较P＜ 0.05视为差异有统计学意义。采用DAS 2.0软件计算药代动力学参数，Origin 8.0绘制药物血浆浓度-时间曲线。

2 结 果

2.1 非那西丁大鼠药动学

空白对照组和清营汤组大鼠静脉注射非那西丁（5 mg/kg）后的药物血浆浓度-时间曲线和主要的药代动力学参数分别见图1和表1。

图1 非那西丁在大鼠体内的药时曲线Fig.1 The mean concentration-time curves of phenacetin inrats （mean ± SD， n=5）

表1 大鼠静注非那西丁后的主要药代动力学参数Table 1 Pharmacokinetic parameters of phenacetin after iv administration in rats （mean ± SD， n=5）

由主要药代动力学参数观察到，清营汤组大鼠与空白对照组比较，非那西丁的AUC、CLz、Vz和Cmax具有显著性差异（P＜0.05），t1/2z的差异具有极显著统计学意义（P＜0.01）。结果表明，清营汤的干预作用，使非那西丁在大鼠体内的药代动力学特征出现显著改变，其代谢速率明显提高，推断清营汤可以诱导大鼠内体CYP1A2酶的活性。

2.2 咪达唑仑大鼠药动学

空白对照组和清营汤组大鼠静脉注射咪达唑仑（5 mg/kg）后的药物血浆浓度-时间曲线和主要的药代动力学参数分别见图2和表2。

由药时曲线和药动参数可以看出，清营汤对咪达唑仑在大鼠体内的药代动力学特征没有显著影响，推断清营汤对大鼠CYP3A1酶的活性可能没有显著影响。

图2 咪达唑仑在大鼠体内的药时曲线Fig.2 The mean concentration-time curves of midazolam in rats （mean ± SD， n=5）

表2 大鼠静注咪达唑仑后的主要药代动力学参数Table 2 Pharmacokinetic parameters of midazolam after iv administration in rats （mean ± SD， n=5）

3 讨 论

随着近年来对营分证实验研究和临床研究的逐步深入，清营汤的药效研究以及临床应用取得了长足的进步。现代医学研究表明，清营汤具有抗炎、退热、抗氧化、改善血液流变学、调节免疫、保护内皮损伤和心肌细胞因子的作用。并且在临床上得到了广泛的应用，主要应用在眼科疾病、皮肤科疾病、感染性疾病以及某些外科疾病的治疗［12］。

药物的相互作用研究对于阐明中药的配伍机理和临床的用药安全具有重要意义，而CYP450酶和P-糖蛋白在药物的相互作用起主要作用，其中以基于肝微粒体CYP450酶的药物相互作用研究更为广泛［13］。CYP450酶为一类亚铁血红素—硫醇盐蛋白的超家族，它参与内源性物质和包括药物、环境化合物在内的外源性物质的代谢，是参与药物I相代谢反应的主要超家族酶系，介导药物的氧化、还原或水解反应［14］。CYP450酶是与药物相互作用关系最为密切的是酶系，凡参与代谢的酶亚型都与药物相互作用有关［15］。而CYP 1A2和CYP3A1是肝脏中比较重要的两种CYP450酶亚型，在药物代谢中具有重要作用［16］。

4 结 论

为了探讨基于细胞色素 P450酶的清营汤药物相互作用，本文采用CYP1A2和CYP3A1特异性探针底物非那西丁和咪达唑仑来研究清营汤对CYP1A2和CYP3A1活性的影响。本研究结果显示，大鼠连续灌胃清营汤后，咪达唑仑的药动学特征无明显变化，推断清营汤对大鼠CYP3A1的酶活性无明显诱导或抑制作用，提示清营汤可能不会影响与其合用的CYP3A1酶底物药物的安全性。但是清营汤组的非那西丁药物代谢速率加快，血浆暴露量减少，据此判断，清营汤可能对CYP1A2的活性具有诱导作用，临床上合用CYP1A2酶的底物药物应该调整给药剂量。尽管存在种属差异，该研究结果对于阐明清营汤的药物相互作用机理以及临床应用的安全性仍具有重要意义。

［1］ 陈宏宁，唐传俭，翟玉祥.试论温病营分证辨治［J］.南京中医药大学学报，1998，14（3）：135-136.

［2］ 陈玉英，马超英.温病营血分证的病理及治法研究概况［J］.江西中医药，2001，32（4）： 56-58.

［3］ 霍玉祥，卞慧敏，杨进，等.清营汤对营热阴伤证动物模型的作用及其机理［J］.中国实验方剂学杂志，2005，10（5）：53-56.

［4］ 王赞华，关小英，艾军.清营解郁活瘀汤对营分证家兔模型血液流变学指标的影响［J］.河南中医，2012，32（10）：1292-1294.

［5］ Gao J， Shi Z， Zhu S， et al. Influences of processed rhubarbs on the activities of four CYP isozymes and the metabolism of saxagliptin in rats based on probe cocktail and pharmacokinetics approaches［J］.J Ethnopharmacol， 2013， 145（2）: 566-572.

［6］Taki Y， Yamazaki Y， Shimura F， et al. Time-dependent induction of hepatic cytochrome P450 enzyme activity and mRNA expression by bilobalide in rats［J］.J Pharmacol Sci， 2009， 109（3）: 459-462.

［7］ Jian TY， He JC， He GH， et al. Scutellarin inhibits cytochrome P450 isoenzyme 1A2 （CYP1A2） in rats［J］. Phytother Res， 2012， 26（8）: 1226-1230.［8］Zhang W， Tan TM， Lim LY. Impact of curcumin-induced changes in P-glycoprotein and CYP3A expression on the pharmacokinetics of peroral celiprolol and midazolam in rats［J］. Drug Metab Dispos， 2007，35（1）: 110-115.

［9］ Saito Y， Nishimura Y， Kurata N， et al. In vivo inhibition of CYP3A-mediated midazolam metabolism by anchusan in rats［J］. J Pharmacol Sci， 2011， 115（3）: 399-407.

［10］Watanabe M， Kumai T， Matsumoto N， et al. Expression of CYP3A4 mRNA is correlated with CYP3A4 protein level and metabolic activity in human liver［J］. J Pharmacol Sci， 2004， 94（4）: 459-462.

［11］Deng RR， Xu CS， Chen X， et al. Resveratrol suppresses the inducible expression of CYP3A4 through the Pregnane X Receptor［J］. J Pharmacol Sci， 2014， 126（2）: 146-154.

［12］戴丽莉.清营汤及其拆方改善营分证血瘀病理变化的相关机理的实验研究［D］.广州：广州中医药大学，2014.

［13］Cuciureanu R， Vlase L， Muntean D， et al. Pharmacokinetic Interaction between linezolid and grapefruit juice in rats［J］. Farmacia， 2010， 58（6）: 770-778.

［14］He X， Feng S， Wang YF， et al. Herb-Drug interaction: effect of isopeulustrin on the metabolism and pharmacokinetics of tetramethylpyrazine by in vivo and in vitro methods［J］. Drug Metabolism Reviews， 2010， 42（2）: 115.

［15］Yokooji T， Kida M， Mori M， et al. Interaction of Rhei Rhizoma extract with cytochrome P450 3A and efflux transporters in rats［J］. Pharmazie，2010， 65（5）: 367-374.

［16］Monshouwer M， Witkamp RF， Pijpers A， et al. Dose-dependent pharmacokinetic interaction between antipyrine and paracetamol in vivo and in vitro when administered as a cocktail in pig［J］. Xenobiotica，1994， 24（4）: 347-55.

Effect of Qingying Decoction on the Pharmacokinetics of Phenacetin and Midazolam in Rats

YANG Lin1，2， HU Xiu1，2， GONG Li1，2， LONG Kun1，2， LAN Yan1，2， WANG Yu-lai1，2
（1. Department of Pharmacy， Huangshi Central Hospital， Affiliated Hospital of Hubei Polytechnic University， Hubei Huangshi 435000， China； 2. Hubei Key Laboratory of Kidney Disease Pathogenesis and Intervention， Hubei Huangshi 435000， China）

The influence of Qingying Decoction on the pharmacokinetics of phenacetin and midazolam in rats was studied， and the effect of Qingying Decoction on the activity of CYP1A2 and CYP3A1 enzymes was discussed. Rats were randomly divided into control group and Qingying decoction group. Each rat in Qingying decoction group was given Qingying decoction for 10 consecutive days and each rat in control group was given equal volume of saline. On day 11， rats were received a single dose of phenacetin and midazolam by intravenous injection， respectively. The concentrations of phenacetin and midazolam were determined by HPLC method. The pharmacokinetic parameters of the two chemicals were calculated with DAS2.0 software. Comparing with the control group， the pharmacokinetic parameters of phenacetin were significant changed in Qingying Decoction group. And the metabolic rate of phenacetin was speed up. But there was no significant difference in the pharmacokinetic parameters of midazolam. The results indicate that Qingying decoction can induce the activity of CYP1A2， but it has no effect on CYP3A1.

Qingying decoction； CYP1A2； CYP3A1； Phenacetin； Midazolam

TQ 460

A

1671-0460（2015）12-2752-03

2015-07-29

杨林（1971-），男，湖北省黄石市人，主管药师，1990年毕业于黄石卫校药剂专业，研究方向：从事临床药学工作。E-mail：yanglinhs@hotmail.com。

王雨来（1972-），男，副主任药师，研究方向：心血管临床药师。E-mail：wangyulaihs@hotmail.com。