细胞团块悬浮培养法对兔关节软骨细胞表型维持效果的研究

罗琦　刘凯

陕西省宝鸡市第二人民医院骨科，陕西宝鸡721000

细胞团块悬浮培养法对兔关节软骨细胞表型维持效果的研究

罗琦刘凯

陕西省宝鸡市第二人民医院骨科，陕西宝鸡721000

目的探索并构建一种操作相对简便、成本较低，且能够较好维持关节软骨细胞表型的体外培养扩增体系。为建立表型稳定的关节软骨细胞库提供新思路。方法改良式三步酶解消化法获取兔关节软骨细胞作为原代种子细胞。分别进行常规单层贴壁培养法扩增传代和细胞团块-悬浮培养并传代。流式细胞仪法对比两种培养体系软骨细胞生长动力学特点。免疫组化技术和Western bolt法对比两种培养体系中次代软骨细胞标志性产物Ⅱ型胶原蛋白的表达情况。结果①兔关节软骨细胞在常规单层贴壁培养体系中扩增较快，但迅速失去圆形外观，并逐渐形成类似于纤维细胞样的长梭形外观，即发生去分化现象。免疫组化染色和Western bolt检测结果显示，Ⅱ型胶原蛋白的表达能力随着传代次数增加而递减，到P4代细胞基本不表达。②悬浮培养培养软骨细胞扩增较慢，其生长曲线近似于原代软骨细胞。各代细胞聚集成团，最大可获得直径约4 mm的软骨细胞团块，单个细胞保持圆形或类圆形外观。各代细胞的Ⅱ型胶原蛋白表达水平基本稳定，并可在细胞周围形成含有Ⅱ型胶原蛋白的类似于细胞外基质样结构。结论悬浮培养模式较为接近软骨细胞的生理条件，可获得表型较稳定的关节软骨子代细胞，并保持了Ⅱ型胶原蛋白合成和分泌能力，可能作为软骨组织工程研究的种子细胞来源之一。

透明软骨；去分化；悬浮培养；组织工程

足够数量的表型正常的关节软骨细胞是软骨组织工程和软骨相关研究的基础。但是，在常规贴壁式单层培养体系中，关节软骨细胞因生长条件的变化和细胞外基质的缺失，导致子代细胞难以维持相对正常的表型。该现象已成为限制软骨组织工程领域研究和临床应用的瓶颈问题之一。为解决这一问题，国内外学者进行大量探索，以求尽可能模拟接近生理条件的关节软骨细胞培养系统。其中较为成功的培养模式包括生物反应器培养以及构建各种生物支架培养模式。但往往因设备费用昂贵、操作过程复杂及支架材料获取相对困难等诸多因素影响其广泛应用［1，4，5，9］。

本研究在总结前人研究经验的基础上，通过改良三步酶消化法获取兔关节软骨细胞［2，6］，分别构建琼脂板-软骨细胞团块悬浮培养体系和常规单层贴壁培养体系［1，3，8］，进行体外扩增和传代。通过观察细胞形态、生长动力学特点和Ⅱ型胶原蛋白表达情况综合判断表型维持情况，现报道如下：

1　对象与材料

1.1实验动物

新西兰大白兔10只，3个月龄，体重2.4～2.7 kg，雌雄不限，购自西安交通大学医学实验动物中心，实验动物合格证号：SCXK（陕）2014-003。

1.2仪器与试剂

超净台（美国LABCONCO公司）、培养箱（HERA CELL）、Olympus相差显微镜、流式细胞仪（BD FACS Calibur）。胰蛋白酶、睾丸透明质酸酶、Ⅱ型胶原蛋白酶等均购自上海微科生化试剂有限公司；DMEM/F12培养基购自上海博升生物科技有限公司；胎牛血清购自Gibco生物科技有限公司；分析纯琼脂糖粉购自西安化学试剂有限公司；Ⅱ型胶原蛋白抗体、GAPDH抗体均购自上海微蒙生物科技有限公司。

1.3实验方法

1.3.1兔关节软骨细胞悬液的制备

无菌条件下取双侧肱骨、股骨远近端关节软骨和胫骨近端关节软骨，切成约1 mm×1 mm×1 mm的软骨块，用含有青霉素和链霉素的聚丁二酸丁二醇酯（PBS）溶液反复冲洗。采用改良三步酶消化法分离软骨细胞：第一步，用0.25%胰蛋白酶/PBS溶液，在37℃摇动式恒温水浴箱中消化30 min。用PBS溶液冲洗软骨块。第二步，取适量0.2%睾丸透明质酸酶-DMEM/F12溶液消化1 h，条件同上。之后用PBS冲洗。第三步，用适量0.2%Ⅱ型胶原蛋白酶-DMEM/F12溶液，消化4 h。在此消化过程中每隔1 h用玻璃滴管手动轻柔吹打5 min，收取酶液，加入新的Ⅱ型胶原蛋白酶液，继续消化。在显微镜下观察直到没有软骨细胞从残存基质上释放。收集含有软骨细胞的消化液，1000 r/min离心10 min后用含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养液重悬，200目滤网过滤。最后用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液将全部细胞重悬。

1.3.2体外培养和传代

1.3.2.1单层贴壁式培养体系的建立和传代用含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养液将软骨细胞悬液调整到5×105个/mL，种植在底面积为75 cm2塑料培养瓶中，在含有5%CO2的37℃培养箱中培养。24 h后第1次更换培养液，以后每隔48 h换液1次，记录形态学变化。培养达到约70%融合程度时分瓶传代培养。共实施4次传代，原代细胞命名为P0，以此类推。

1.3.2.2琼脂板-软骨细胞团悬浮式培养体系的建立和传代取2 g琼脂糖粉，加入98 mL PBS溶液，煮沸至琼脂糖粉完全溶解并拌均匀。冷却后即形成2%的琼脂凝胶。使用水浴加热至凝胶彻底融化。取1 mL琼脂糖溶液，加入直径为10 cm的培养皿中，沿水平方向迅速摇动培养皿，使琼脂糖均匀地铺在皿底，静置至琼脂糖彻底凝固，培养皿底部即形成一层完整均匀的琼脂板。

取适量软骨细胞悬液，用含10%胎牛血清的DMEM/ F12培养液调整到5×105个/mL，种植在预铺琼脂板的培养皿中。48 h左右软骨细胞即形成悬浮的细胞团块，进行首次换液。以后每隔48 h换液1次。观察培养过程中细胞团块体积变化，通常至6 d左右细胞团块不再增大，即作为传代的时机。传代时收取细胞团块，用Ⅱ型胶原蛋白酶DMEM/F12溶液消化1 h，每隔30 min辅以轻柔吹打2 min，直至软骨细胞完全分散。

1.3.3两种培养条件下软骨细胞生长动力学研究

应用流式细胞仪荧光计量法绘制两种培养体系中软骨细胞的生长曲线。取48孔细胞培养板，分为A、B两组，分别用于单层贴壁式培养（A组）、悬浮式培养（B组）。将原代软骨细胞按照前面所述的培养方法分别种植在A、B两组的琼脂板上。每天从每个培养体系中取12个孔的样本用于流式细胞仪检测。以P0细胞的荧光强度值为标准，将子代细胞样本的荧光强度值与之相比，所得比值即为细胞的扩增倍数。以时间为横坐标，扩增倍数为纵坐标，绘制细胞生长曲线。

1.3.4Ⅱ型胶原蛋白表达检测

以A组和B组的P0、P2、P4代细胞为研究对象，依标准流程分别进行Ⅱ型胶原蛋白免疫组化和Western blot检测。

1.3.4.1免疫组化取样本细胞，4%多聚甲醛固定，经PBS冲洗后用山羊血清封闭液孵育20 min，以此滴加Ⅰ抗、Ⅱ抗（生物素标记）并分别在37℃孵育1 h，DAB显色后苏木精复染2 min，封片并镜检。结果判定：免疫组化结果表现为无染色、浅黄色细颗粒、棕黄色颗粒和耀眼可见的褐黄色粗颗粒，分别记为阴性、弱阳性、阳性、强阳性。

1.3.4.2 Westernblot取样本细胞悬液，4℃下12000r/min离心5 min，取上清于-20℃保存。制备12%聚丙烯酰胺凝胶。充分凝固后，放入电泳槽，加入电冲液，取约10 μg处理好的蛋白样品上样电泳。电泳完成后将电泳胶置转移缓冲液中平衡20 min。并将硝酸纤维素膜于转移缓冲液中平衡20 min。转膜顺序：负极-专用滤纸-电泳胶-硝酸纤维素膜-专用滤纸-正极。室温下转膜120 min。转膜所得的硝酸纤维素膜用5%脱脂奶粉室温封闭2 h。之后分别进行一抗孵育（稀释比例为1∶200）和二抗孵育（稀释比例为1∶1000），用凝胶成像系统进行扫描和分析。

2　结果

2.1形态学结果

2.1.1单层贴壁式培养的软骨细胞的形态学变化

原代软骨细胞植入普通培养瓶后，数小时即开始贴壁，24 h内绝大多数细胞完成贴壁。贴壁后的细胞呈不规则的多边形和多角形。原代细胞培养1周左右达到80%的融合。显微镜下观察绝大多数细胞形态呈多边形，胞浆内可见较多的囊泡样结构，为富含Ⅱ型胶原蛋白的基质小泡。

第1次传代之后的软骨细胞（P1）贴壁速度较原代细胞明显增快，基本上在6 h之内就完成贴壁，培养7 d时达到80%融合，胞浆内可见基质囊泡。P2代软骨细胞贴壁更快，4 h左右即完成贴壁。从P2开始，软骨细胞形态变得更加细长。同时，软骨细胞的增殖速度亦有所加快，在培养6 d左右即可达到70%的融合，但是胞浆内基质囊泡明显减少。在P3～P4阶段，增殖更为迅速，4～5 d即可达到70%的融合，但是细胞形态越来越接近长梭形，类似于成纤维细胞，胞浆内基质囊泡基本消失。原代软骨细胞形态特点完全消失。见图1。

图1　单层贴壁式培养软骨细胞的形态学变化

2.1.2琼脂板-细胞团块悬浮式培养的软骨细胞的形态学变化

原代软骨细胞种植在预铺有琼脂板的培养皿中后，48 h内即可形成肉眼可见的细胞团块，直径约为1.5 mm，呈不透明的类圆形团块，悬浮于培养液中。镜下观察，软骨细胞团块较松散。随后，细胞团块的体积逐渐增大。悬浮培养10 d左右最大的细胞团块直径可达到4 mm。镜下观察细胞紧密排布，基本上不能分辨细胞轮廓。此后，细胞团块体积不再增大，培养至14 d后体积反而有所缩小。P1～P4代软骨细胞悬浮培养所得的细胞团块在镜下观察形态无显著改变。见图2。

图2　琼脂板-悬浮培养的P4代软骨团块

2.2单层贴壁式培养和悬浮式培养生长动力学的特点

2.2.1软骨细胞在单层贴壁式培养环境中生长动力学特点

(1) 针对柴储混合电力系统,提出了柴油发电机和储能系统间的负荷频率协调控制,通过将调频信号精细化处理为高低频分量,由柴油发电机和储能系统分别承担低频分量和高频分量,以实现不同发电装置对频率管理的协调控制,提高了发电装置的利用率。

原代细胞培养初期，细胞增殖较慢，生长曲线坡度较为平缓。经过4 d左右进入对数生长期，生长曲线的坡度较前陡峭；培养8 d后形成接近水平的平台期；继续培养至10 d以上进入衰退期，生长曲线向下转折。

随着传代次数的增加，软骨细胞增殖周期渐缩短；到了P4阶段，只需1.5 d左右即可进入对数增殖期，生长曲线不具有平台阶段；在5 d左右进入衰退期。见图3。

2.2.2软骨细胞在琼脂板-细胞团块悬浮培养条件下生长动力学特点

在琼脂板-细胞团块悬浮式培养体系中，各代次的软骨细胞的生长曲线模式高度一致，起始部分很平缓，从第3天起，曲线坡度逐渐升高，但始终未达到贴壁式培养的上升速度；到培养的第10天后，曲线的斜率又逐渐趋于平缓；培养至13 d以上时，曲线略向下转折，进入生长的衰退期。与单层贴壁式培养的软骨细胞比较，悬浮培养的软骨细胞生长动力学特点更为稳定，且更接近于原代软骨细胞。见图4。

图3　单层贴壁式培养的软骨细胞的生长曲线

图4　琼脂板-细胞团块悬浮培养的软骨细胞的生长曲线

2.3两种培养条件下软骨细胞Ⅱ型胶原蛋白表达水平的比较

2.3.1单层贴壁式培养环境中软骨细胞免疫组化特点

为了明确不同培养条件下软骨细胞Ⅱ型胶原蛋白表达水平，本实验分别进行免疫组化研究。结果显示，原代软骨细胞Ⅱ型胶原蛋白表达呈强阳性，单层贴壁式培养组传代至第二代时，Ⅱ型胶原蛋白表达水平明显降低，传代至第四代时，几乎不表达Ⅱ型胶原蛋白。而各代次细胞之间，均无Ⅱ型胶原阳性染色表现。见图5。

图5　单层贴壁式培养软骨细胞的Ⅱ型胶原蛋白（免疫组化染色，200×）

2.3.2琼脂板-细胞团块悬浮培养条件下软骨细胞免疫组化特点

琼脂板-细胞团块悬浮培养组在各代次均可稳定表达Ⅱ型胶原蛋白，该Ⅱ型胶原蛋白成分不仅出现在细胞浆内，而且在细胞周围也有表达。见图6。

图6　琼脂板-细胞团块悬浮培养的软骨细胞Ⅱ型胶原蛋白（免疫组化染色，200×）

2.3.3 Western blot验证不同培养条件下软骨细胞产生Ⅱ型胶原蛋白的能力

通过Western blot检测进一步证实，单层贴壁式培养的软骨细胞，Ⅱ型胶原蛋白表达能力逐代减弱；而琼脂板-细胞团块悬浮培养的各代次软骨细胞均保持较稳定的Ⅱ型胶原蛋白表达。见图7。

图7　两种培养条件下软骨细胞Ⅱ型胶原蛋白Western blot检查

3　讨论

体外软骨细胞的培养是了解软骨细胞生物学性状的重要方法，有助于研究骨性关节炎的发病机制，对促进软骨组织工程的发展有重要意义。近年来随着科技研究的飞速发展，已发现多种方式可体外培养软骨细胞，并受多种因素影响，如力学因素、氧浓度因素和体内细胞因子因素等。软骨细胞在体内生长始终处于一定的应力环境中，且在体内处于相对缺氧的状态，同时由体内复杂的细胞因子网络如肿瘤坏死因子α、转化生长因子β等共同作用生长。体外培养软骨细胞受上述因素的影响，会出现退变现象，一般从第4代后细胞表现为逐渐变为梭形增值能力下降，同时合成和分泌Ⅱ型胶原蛋白的能力也随之降低，称之为“去分化”现象［7］。

“去分化”现象已成为限制软骨细胞组织工程的瓶颈问题之一。通过体外培养体系中模拟关节软骨细胞的生理环境而获得数量且具有相对正常表型的关节软骨细胞是解决该问题的有效手段。在该领域内，国内外诸多学者开发出多种关节软骨细胞培养模式。并且已经取得相当进展［8］。其中，公认较为成功的是生物反应器培养方法，此外海藻酸钠凝珠培养也获得表型较稳定的软骨细胞［10-13］。但是上述方法均存在一定的不足，如生物反应器购置费用高昂、试剂消耗量较大、运转成本较高。而在海藻酸钙凝珠培养体系中，凝珠制备条件不易控制、传代过程操作繁琐等诸多因素都在相当程度上限制了其广泛应用。本研究旨在探索一种操作相对简便，且能通过模拟关节软骨细胞在体环境，使得次代细胞保持关节软骨细胞表型，能够稳定表达Ⅱ型胶原蛋白。

本研究发现，与常规的单层贴壁式培养方法比较，琼脂板-软骨细胞悬浮培养法可使得细胞聚集形成软骨细胞团块，较为接近软骨细胞的生理条件，从而可获得表型较稳定的关节软骨子代细胞，保持了Ⅱ型胶原蛋白的合成能力，并且在细胞外形成了含有Ⅱ型胶原蛋白成分的类似于细胞外基质的物质。该培养模式通过避免细胞贴壁而促使软骨细胞聚集并扩增，用相对简易的方法获得能稳定表达Ⅱ型胶原蛋白的软骨细胞，有可能作为软骨组织工程的种子细胞来源。

目前国内外研究已形成共识，细胞外基质的存在对于维持关节软骨细胞的表型至关重要。有研究报道，软骨基质中的某些成分与关节软骨表面的整合素分子相互结合，形成整合素介导的细胞跨膜信号途径，进而刺激细胞稳定的表达和分泌Ⅱ型胶原蛋白、蛋白多糖等重要分子。另一方面，在生理条件下，关节软骨细胞的表型维持依赖于其自分泌和旁分泌功能，软骨细胞通过分泌细胞外基质、接受多种生长因子调控等不同机制对其生理功能进行调节［14-18］。

但是在体外培养过程中，为了获得原代软骨细胞而进行的多步酶消化过程使得关节软骨细胞完全从软骨基质上释放，形成单个的游离细胞，细胞外基质-整合素介导的跨膜信号传导通路结构完全丧失，细胞自分泌、旁分泌环境也受到极大影响，进而失去了软骨基质对关节软骨细胞生理功能重要调控作用。

基于上述考虑，在本研究中，通过在培养皿底部预先铺制琼脂板，使得原代软骨细胞不能进行贴壁生长，从而在培养液中悬浮并逐渐聚集成细胞团块，在一定程度上模拟了关节软骨细胞的生理环境。进一步研究发现，聚集成团块的次代软骨细胞不仅能进行数量上的增殖，更重要的是保持了稳定表达Ⅱ型胶原蛋白的能力。免疫组化染色显示悬浮培养的软骨细胞，其细胞浆内和细胞周围均有Ⅱ型胶原蛋白表达，并且在细胞周围形成类似于细胞外基质的成分。笔者分析，软骨细胞相互聚集而形成细胞团块，使得其表达的Ⅱ型胶原蛋白有机会在细胞外聚集起来，并且其自分泌的某些细胞因子不至于随更换培养液而完全丢失，从而对维持其生理功能起到积极意义。但因为软骨细胞聚集的较为紧密，其深部的细胞难以获得营养供应，因此最终获得的细胞团块大小有限。本研究中获得最大细胞团块直径约4 mm，到培养的后期团块反而有所缩小，该现象的发生时间与生长曲线的模式基本符合，前人亦有类似报道［19-22］，因此笔者考虑其原因可能为团块深部细胞因缺乏营养供应而发生凋亡。

本研究不足之处在于，生理条件下关节软骨细胞接受压应力负荷调控，而在作者构建的培养体系中，无法对获得的软骨细胞团块实施压力干预，因此细胞外基质的重构难以实现。另一方面，生理条件下的关节软骨细胞属于“多基质、少细胞”的排列模式，具有典型的软骨陷窝结构［17-18］，但本实验所获得的软骨细胞团块特点为细胞排布紧密，细胞外基质样成分较少。

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Effect of cell-pellets suspension culture mode preserves the phenotype of rabbit chondrocytes in vitro

LUO QiLIU Kai
Department of Orthopedic，the Second People's Hospital of Baoji City，Shaanxi Province，Baoji721000，China

Objective To explore and build relatively convenience and low-costing culture mode to preferably preserve the phenotype of chondrocytes in vitro which may provide new ideas for establish of cartilage cell bank.Methods Rabbit cartilage cells were collected by a modified three-step digestion method.Traditional mono-layer adherent culture and chondrocyte-pellets suspension culture and passages were proceeded respectively.Growth dynamic characters of both culture systems were determined and compared by flow cytometry technique.Immunohistochemistry and Western bolt were carried out to compare the expression of typeⅡcollagen.Results①Amplification of chondrocytes from rabbit cartilage proved to be faster in mono-layer adherent culture with the loss of its original round shape and became similar to fibrocytes，which was determined as phenotype degeneration.Immunohistochemistry study and Western bolt examination both showed that，the expression of typeⅡcollagen decreased gradually with passages carried out，typeⅡcollagen was barely expressed in the fourth passage.②Chondrocytes increased slower in pellets suspension culture with a growth curve similar to primary cartilage cells.In each passages，cells aggregated and pellets were formed with a largest diameter about 4 mm.TypeⅡcollagen was expressed steady in each passage and extra-cellular matrix was precipitated around chondrocytes.Conclusion Suspension culture mode is relatively close to the physiological conditions of cartilage cells，daughter cells of chondrocyte phenotype is available，which preserves the ability of the stable expression of typeⅡcollagen，and may be served as a choice for cartilage tissue engineering.

Chondrocyte；Dedifferentiation；Suspension culture；Tissue engineering

R332

A

1673-7210（2015）12（b）-0020-06

2015-06-18本文编辑：任念）

罗琦（1971.10-），男，副主任医师；研究方向：关节外科。