三黄片对糖尿病大鼠胸主动脉细胞间黏附分子-1及血管细胞间黏附分子-1表达的影响

田风胜　王佟　王霞　崔荣岗　李娟　李华君

1.河北医科大学附属沧州中西医结合临床医学院内分泌科，河北沧州061001；2.河北医科大学附属沧州中西医结合临床医学院心血管内科，河北沧州061001；3.河北省沧州高等医学专科学校，河北沧州061001

三黄片对糖尿病大鼠胸主动脉细胞间黏附分子-1及血管细胞间黏附分子-1表达的影响

田风胜1王佟2王霞3崔荣岗1李娟1李华君1

1.河北医科大学附属沧州中西医结合临床医学院内分泌科，河北沧州061001；2.河北医科大学附属沧州中西医结合临床医学院心血管内科，河北沧州061001；3.河北省沧州高等医学专科学校，河北沧州061001

目的探讨三黄片对糖尿病大鼠胸主动脉细胞间黏附分子-1（ICAM-1）及血管细胞间黏附分子-1（VCAM-1）表达的影响。方法根据随机数字表法，将所有大鼠分为正常组10只，造模组30只。从造模组中随机选取糖尿病大鼠，分为模型对照组10只及三黄片组10只。模型对照组及正常组给予生理盐水灌胃，三黄片组给予三黄片研末灌胃。给药8周后，模型对照组及三黄片组各死亡大鼠1只，最终两组各9只大鼠。测定血糖、血脂、血浆内皮素-1（ET-1）、一氧化氮（NO）水平。采用SP免疫组化染色法观察胸主动脉病理切片ICAM-1及VCAM-1的阳性表达。结果模型对照组及三黄片组给药前、给药后的血糖水平高于正常组（P＜0.05），但模型对照组与三黄片组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。模型对照组及三黄片组三酰甘油高于正常组（P＜0.05），但模型对照组与三黄片组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。模型对照组及三黄片组ET-1水平较正常组升高（P＜0.05），三黄片组ET-1水平较模型对照组下降（P＜0.05）。模型对照组及三黄片组NO水平较正常组降低（P＜0.05），三黄片组NO水平较模型对照组升高（P＜0.05）。模型对照组及三黄片组ICAM-1及VCAM-1阳性表达明显高于正常组（P＜0.01），三黄片组ICAM-1及VCAM-1阳性表达明显低于模型对照组（P＜0.01）。结论三黄片能抑制糖尿病大鼠ET-1的升高及NO的降低，且能抑制ICAM-1及VCAM-1的表达。

三黄片；糖尿病；细胞间黏附分子-1；血管细胞间黏附分子-1

糖尿病血管病变最基本的病理改变就是动脉硬化，是糖尿病的慢性并发症之一，包括大血管病变和微血管病变，是糖尿病患者致残、致死的最主要原因。血管内皮功能的损伤是动脉硬化的早期表现。动脉硬化是一种炎症疾病。糖尿病患者呈低度炎症状态，包括超敏C反应蛋白、肿瘤坏死因子-α及一些细胞因子的过度表达。研究表明，细胞间黏附分子-1（ICAM-1）及血管细胞间黏附分子-1（VCAM-1）的过度表达参与动脉粥样硬化形成的发生和发展［1］。本研究主要观察三黄片对糖尿病大鼠血管内皮的影响。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

6周龄，雄性清洁级SD大鼠40只，平均体重（220±20）g，购于河北医科大学实验动物中心（合格证号：1405034）。链脲佐菌素（STZ）、柠檬酸钠：美国Sigma公司；内皮素-1（ET-1）及一氧化氮（NO）试剂盒：武汉博士德生物工程有限公司；兔抗鼠多克隆ICAM-1（货号：PB0054）及VCAM-1抗体（货号：BA3840）：武汉博士德公司；血糖仪（罗康全活力型）：德国罗氏公司；日立7600-010全自动生化分析仪：日本日立公司；多功能真彩色细胞图像分析管理：美国Media Cybernetics公司。

1.2方法

1.2.1动物模型建立适应性饲养1周，随机抽取30只按文献［2-3］方法略作改进，一次性腹腔注射STZ 60 mg/kg，72 h后尾静脉取血，测血糖≥16.7 mmol/L，血糖平稳1周后，确定为糖尿病大鼠。剩余10只大鼠设为正常组，腹腔注射等量的柠檬酸钠缓冲液。

1.2.2分组与给药糖尿病大鼠随机抽分为模型对照组10只及三黄片组（哈药集团三精制药有限公司）10只，其余弃去不用。实验期间大鼠自由进食水，喂食标准饲料，每天更换垫料。三黄片组给予生药10 g/kg体重灌胃，三黄片每天临时配制，其余两组每日给予同等剂量生理盐水灌胃。

1.2.3采血与血管免疫组化持续给药8周后，隔夜禁食12 h，不禁水。以3%戊巴比妥（80 mg/kg）腹腔注射麻醉，腹主动脉采血测定血脂、NO及ET-1。同时留取胸主动脉，制备病理切片，SP免疫组化染色，应用图像分析软件分析大鼠胸主动脉组织中ICAM-1及VCAM-1阳性表达。

1.3统计学方法

采用SPSS 13.0统计软件对数据进行分析和处理，计量资料以均数±标准差表示，自身前后对照比较采用配对t检验，多组间比较采用方差分析，组间多重比较采用Dunnett′s t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

模型对照组1只死于继发性腹部感染（可能为腹部注射STZ导致），三黄片组死亡1只，死因不详。

2.1三组给药前后血糖水平比较

三组给药前后血糖水平分别比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；模型对照组及三黄片组给药前、给药后的血糖水平高于正常组（P＜0.05），但模型对照组与三黄片组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1　三组给药前后血糖水平比较（mmol/L

表1　三组给药前后血糖水平比较（mmol/L

注：与正常组比较，*P＜0.05

组别给药前给药后正常组（n=10）模型对照组（n=9）三黄片组（n=9）5.98±1.05 21.22±3.61*21.06±2.21*6.08±1.28 22.10±4.09*21.39±2.86*

2.2三组血脂水平比较

三组总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇及低密度脂蛋白胆固醇组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）；模型对照组及三黄片组三酰甘油高于正常组（P＜0.05），但模型对照组与三黄片组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2　三组血脂水平比较（mmol/L

表2　三组血脂水平比较（mmol/L

注：与正常组比较，*P＜0.05

组别总胆固醇三酰甘油高密度脂蛋白胆固醇低密度脂蛋白胆固醇正常组（n=10）模型对照组（n=9）三黄片组（n=9）2.23±0.24 2.34±0.29 2.22±0.22 0.36±0.09 0.99±0.27*0.91±0.29*1.24±0.20 1.19±0.13 1.28±0.21 0.41±0.07 0.46±0.10 0.39±0.09

2.3三组ET-1及NO水平比较

模型对照组及三黄片组ET-1水平较正常组升高（P＜0.05），三黄片组ET-1水平较模型对照组下降（P＜0.05）；模型对照组及三黄片组NO水平较正常组降低（P＜0.05），三黄片组NO水平较模型对照组升高（P＜0.05）。见表3。

表3　三组ET-1及NO水平比较（mmol/L，x±s）

2.4三组ICAM-1及VCAM-1比较

模型对照组及三黄片组ICAM-1及VCAM-1阳性表达明显高于正常组（P＜0.01），三黄片组ICAM-1及VCAM-1阳性表达明显低于模型对照组（P＜0.01）。见表4。正常组可见少量ICAM-1（棕黄色颗粒样）表达（图1A），模型对照组及三黄片组可见大量的ICAM-1表达（图1B、1C）；正常组可见少量VCAM-1（棕黄色颗粒样）表达（图2A），模型对照组及三黄片组可见大量的VCAM-1表达（图2B、2C）。

表4　三组ICAM-1及VCAM-1阳性表达情况比较（%，

表4　三组ICAM-1及VCAM-1阳性表达情况比较（%，

注：与正常组比较，*P＜0.01；与模型对照组比较，▲P＜0.01；ICAM-1：细胞间黏附分子-1；VCAM-1：血管细胞间黏附分子-1

组别ICAM-1VCAM-1正常组（n=10）模型对照组（n=9）三黄片组（n=9）4.61±2.54 34.91±10.00*23.44±5.38*▲8.75±3.86 35.97±8.90*23.74±7.88*▲

图1　胸主动脉ICAM-1表达（SP法，400×）

图2　胸主动脉VCAM-1表达（SP法，400×）

3　讨论

糖尿病合并血管病变早期特征即动脉粥样硬化，糖尿病动脉硬化是糖尿病大多数慢性并发症的共同病理基础，血管内皮细胞功能的受损是动脉硬化的启动因素。高血糖导致氧化应激的增加及一些炎性因子的过度激活，使血管内皮功能紊乱，导致ET-1分泌增加及NO分泌减少，进而引起血流动力学紊乱，血流动力学失衡又会加重血管内皮损伤，其损伤是糖尿病动脉硬化的共同病理表现及重要原因［4-5］。慢性炎症是动脉粥样硬化形成与进展的重要的独立危险因素［6］，多种炎性因子如C反应蛋白、白细胞介素-6、肿瘤坏死因子-α等介导的炎性反应与2型糖尿病血管并发症的关系密切，在糖尿病血管病变的发病机制中发挥重要作用。大量证据显示，炎症导致细胞黏附分子异常、白细胞附壁等，最终引发内皮细胞功能异常，甚至凋亡。ICAM-1及VCAM-1属于免疫球蛋白超家族成员，主要表达于血管内皮细胞、淋巴细胞、单核细胞等。VCAM-1可引起表面效应细胞活化，免疫反应被启动，介导淋巴细胞等与血管内皮细胞黏附，损伤血管内皮，导致血管功能障碍［7］。研究表明，动脉硬化的发生和发展与VCAM-1等黏附因子的过度表达相关［8］。郑永强等［9］研究表明，抑制ICAM-1及VCAM-1的表达，可以防治糖尿病性动脉粥样硬化。

三黄片的主要成分为大黄、黄芩、盐酸小檗碱，有较多研究表明，其组分具有抑制炎性因子表达的作用。研究表明，大黄具有降低大鼠ET-1及升高NO的作用，能够保护糖尿病大鼠内皮依赖的血管舒张功能，且能抑制ICAM-1及VCAM-1的表达，具有抗动脉硬化作用［10］。小檗碱能降低肾脏血管内皮生长因子的表达，并能改善糖尿病肾病大鼠发病过程中的生化指标和肾脏病理损伤［11］；小檗碱可减少白细胞介素-6及肿瘤坏死因子-α的分泌，减轻内脂素诱导的人脐静脉内皮细胞损伤［12］；陶婷婷等［13］研究表明，在高胰岛素条件下，人脐静脉内皮细胞分泌前列环素2（PGI2）减少、ET-1增多；0.50、5.00 g/mL的小檗碱可提高人脐静脉内皮细胞对PGI2的分泌水平，减少ET-1的分泌，呈反向调节作用；朱凌波等［14］研究表明，小檗碱可显著降低高脂饮食兔血清总胆固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白胆固醇水平，显著降低血清氧化低密度脂蛋白、脂蛋白相关磷脂酶A2、单核细胞趋化蛋白-1、基质金属蛋白酶-9水平，升高血清基质金属蛋白酶抑制物-1水平，可显著改善动脉硬化病变程度及稳定斑块，其机制可能与小檗碱能显著降低血清各项炎症标志物水平等作用有关。李淼等［15］发现，三黄方及方中大黄、黄芩、黄柏在浓度范围100～1.5625 mg/L对小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞无显著毒性，三黄方通过抑制细胞因子NO、白细胞介素-1β、前列腺素E2、肿瘤坏死因子-1α释放发挥其抗炎作用。

卢聪等［16］研究表明，大黄素抑制血管平滑肌细胞增殖。大黄酸能改善过氧化氢（H2O2）诱导损伤的血管内皮细胞形态，促进其增殖，抑制其凋亡，提升NO、一氧化氮合酶（NOS）的含量和超氧化物歧化酶（SOD）的活力，对血管内皮细胞有一定的保护作用［17］；大黄酸能抑制白细胞介素-6诱导的血管平滑肌的促增殖作用和表型转换，可能与调节基质金属蛋白酶-3/基质金属蛋白酶抑制剂1比值及增殖细胞核抗原的表达［18］。景浩然等［19］研究表明，大黄酚可以在不影响小胶质细胞的细胞活性情况下，显著抑制内毒素（LPS）诱导的小胶质细胞炎性因子NO、肿瘤坏死因子-α的表达。李岩等［20］研究表明，黄芩苷能减少炎性因子肿瘤坏死因子-α的过度表达，其作用机制可能与黄芩苷抑制LPS引起的巨噬细胞CD36表达有关，从抗炎角度初步探讨了黄芩苷抗动脉粥样硬化的作用机制。黄芩苷还可能部分通过上调NOS活性，增加NO含量，从而实现抑制血管平滑肌细胞增殖的作用［21］。

本研究结果显示，复方清热类中药三黄片对糖尿病大鼠血糖及血脂无影响。三黄片具有明显抑制ET-1升高、抑制NO降低的作用，但不能到达正常水平，推断其对血管内皮具有保护作用。糖尿病大鼠胸主动脉ICAM-1及VCAM-1表达上调，表明其在糖尿病血管病变的发生、发展中起作用，而三黄片可以明显抑制血管ICAM-1及VCAM-1的表达。本研究发现，三黄片具有改善血管内皮功能，同时抑制糖尿病大鼠早期ICAM-1及VCAM-1的过度表达，具有防治糖尿病血管病变的作用。

综上所述，三黄片对糖尿病大鼠血糖、血脂没有影响，其对糖尿病血管的保护作用不是通过降低血糖实现，可能是通过多环节、多靶点实现。

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Influence of Sanhuang Tablets on intercellular adhesion molecule-1 and vascular cell adhesion molecule-1 expression of thoracic aorta in diabetes mellitus rats

TIAN Fengsheng1WANG Tong2WANG Xia3CUI Ronggang1LI Juan1LI Huajun1
1.Department of Endocrinology，Affiliated Cangzhou Integrated Chinese and Western Medicine Clinical Medical School of Hebei Medical University，Hebei Province，Cangzhou061001，China；2.Department of Cardiology，Affiliated Cangzhou Integrated Chinese and Western Medicine Clinical Medical School of Hebei Medical University，Hebei Province，Cangzhou061001，China；3.Cangzhou Medical College of Hebei Provence，Hebei Province，Cangzhou 061001，China

Objective To explore influence of Sanhuang Tablets on intercellular adhesion molecule-1（ICAM-1）and vascular cell adhesion molecule-1（VCAM-1）expression of thoracic aorta in diabetes mellitus rats.Methods According to method of random number table，all rats were divided into normal group（n=10）and making model group（n=30）.DM rats randomly selected from making model group were divided into model control group（n=10）and Sanhuang Tablets group（n=10）.Model control group and normal group were given normal saline lavage，Sanhuang Tablets group was given Sanhuang Tablets lavage.After 8 weeks of administration，model control group and Sanhuang Tablets group was dead one rat respectively，the final two groups of 9 rats.Blood sugar，blood lipids，endothelin-1（ET-1），nitric oxide（NO）levels were detected.ICAM-1 and VCAM-1 expression of thoracic aortic pathology were observed by using SP immunohistochemical staining.Results Before and after administration，blood glucose levels of model control group and Sanhuang Tablets group were higher than those of normal group（P＜0.05），there was no statistical difference between model control group and Sanhuang Tablets group（P＞0.05）.Triglyceride levels of model control group and Sanhuang Tablets group were higher than those of normal group（P＜0.05），there was no statistical difference between model control group and Sanhuang Tablets group（P＞0.05）.ET-1 levels of model control group and Sanhuang Tabletsgroup were higher than those of normal group（P＜0.05），ET-1 level of Sanhuang Tablets group was lower than that of model control group（P＜0.05）.NO levels of model control group and Sanhuang Tablets group were lower than those of normal group（P＜0.05），NO level of Sanhuang Tablets group was higher than that of model control group（P＜0.05）. Positive expression of ICAM-1 and VCAM-1 in model control group and Sanhuang Tablets group were significantly higher than those in normal group（P＜0.01）.Positive expression of ICAM-1 and VCAM-1 in Sanhuang Tablets group were significantly lower than those in model control group（P＜0.01）.Conclusion Sanhuang Tablets can inhibit increase of ET-1 and decrease of NO in diabetic rats，and it can inhibit the expression of VCAM-1 and ICAM-1.

Sanhuang Tablets；Diabetes；Intercellular adhesion molecule-1；Vascular cell adhesion molecule-1

R-332

A

1673-7210（2015）12（b）-0016-05

2015-08-17本文编辑：李亚聪）

河北省沧州市科学技术研究与发展指导计划项目（09ZD284）。