左旋丁苯酞对慢性脑缺血大鼠海马β-淀粉样肽及Tau蛋白磷酸化的影响

罗　超　吕淑英　潘龙瑞　赵万红▲.湖北医药学院基础医学院，湖北十堰44000；.湖北十堰铁锋医院麻醉科，湖北十堰44000

左旋丁苯酞对慢性脑缺血大鼠海马β-淀粉样肽及Tau蛋白磷酸化的影响

罗超1吕淑英2潘龙瑞1赵万红1▲
1.湖北医药学院基础医学院，湖北十堰442000；2.湖北十堰铁锋医院麻醉科，湖北十堰442000

目的观察左旋丁苯酞（L-NBP）对慢性脑缺血大鼠认知的改善作用以及对海马β-淀粉样肽（Aβ1-42）水平以及Tau蛋白磷酸化的影响，探讨其作用机制。方法采用结扎双侧颈总动脉建立慢性脑缺血模型，实验分四组：假手术组、模型组、L-NBP 30 mg/kg组和L-NBP 120 mg/kg组。假手术组、模型组予植物油灌胃治疗，L-NBP 30mg/kg组和L-NBP 120mg/kg组连续给予45 d治疗，用Morris水迷宫检测大鼠的空间学习和记忆能力。采用酶联免疫吸附试验法检测大鼠海马组织中Aβ1-42的含量；采用免疫印迹法检测Tau蛋白的磷酸化水平，HE染色检测海马神经元的形态。结果在水迷宫空间探索实验中，L-NBP 30 mg/kg组和L-NBP 120mg/kg组大鼠在目标象限时间百分比分别为（26.3±6.4）%和（28.6±5.8）%，与模型组［（15.2±5.2）%］比较，差异均有高度统计学意义（P＜0.01）；L-NBP明显减少了大鼠海马Aβ1-42含量，L-NBP 30mg/kg组和L-NBP 120mg/kg组分别为（1.07± 0.30）和（0.99±0.18），L-NBP 120mg/kg组与模型组（1.36±0.24）比较差异有高度统计学意义（P＜0.01）；L-NBP 30mg/kg组及L-NBP 120mg/kg组大鼠海马组织磷酸化Tau蛋白表达水平［（1.72±0.18）、（1.43±0.35）］较模型组（1.82±0.23）明显降低，L-NBP120mg/kg组与模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。HE染色观察到L-NBP可明显改善海马神经元的形态异常。结论L-NBP改善慢性脑缺血大鼠的学习记忆缺陷，是通过减少海马Aβ1-42的水平，减轻Tau蛋白的磷酸化，改善海马神经元的形态异常，保护了海马神经元。

左旋丁苯酞；β-淀粉样肽；P-Tau蛋白；海马

左旋丁苯酞（L-NBP）是丁苯酞光学异构体。在以往研究发现，3-N-Butylphthalide可以减轻大脑皮质B-淀粉样肽含量水平，改善脑低灌注引起的血管性痴呆大鼠的学习记忆［1］。但不清楚L-NBP是否与大鼠海马Tau蛋白的磷酸化和Aβ1-42的表达水平存在一定的关联。通过结扎大鼠两侧颈总动脉制备慢性脑缺血的模型，观察L-NBP对其海马β-淀粉样肽（Aβ1-42）含量改变、Tau蛋白Ser396位点磷酸化水平改变以及HE染色检测海马神经元的形态改变上，研究探讨L-NBP的主要作用机制。

1　材料与方法

1.1材料

1.2模型制备及给药分组

大鼠手术前12 h禁食不禁水，麻醉用10%的水合氯醛按300mg/kg腹腔注射。模型组、L-NBP 30mg/kg组、L-NBP 120 mg/kg组游离大鼠两侧颈总动脉并永久性结扎3个月，假手术组游离大鼠两侧颈总动脉后不结扎，术后给予青霉素腹腔注射200 kU/d连续治疗3 d。将大鼠分为假手术组、模型组、L-NBP 30mg/kg组、L-NBP 120 mg/kg组，每组各6只。假手术组、模型组给予花生油2 mL/kg灌胃；L-NBP治疗两组把L-NBP溶解于花生油中连续45 d分别给予30mg/kg组和L-NBP 120mg/kg组灌胃治疗。

1.3检测大鼠记忆行为能力

结束灌胃前5 d进行定位航行训练，Morris水迷宫监测并记录大鼠的游泳轨迹。在位航行训练每只大鼠均接受每天2次，间隔10 min训练寻找平台。第6天移去平台，进行空间探索实验，让大鼠寻找平台自由游泳60 s记录4个象限活动的时间。

1.4测定大鼠海马Aβ1-42含量

水迷宫实验结束后，断头取脑在冰浴上分离海马，海马组织匀浆。采用ELISA方法，对标准品倍比稀释，Aβ1-42含量的测定方法按照试剂盒说明书进行，测定海马中Aβ1-42含量。

1.5测定大鼠海马磷酸化Tau蛋白表达水平

取海马组织匀浆方法同上，采用Western blot方法，对蛋白条带进行半定量分析用图像分析软件，磷酸化Tau蛋白的相对含量=磷酸化Tau条带灰度值/内参Actin灰度值。

1997年，孟晚舟继续研读学业，在华中科技大学取得会计硕士学位，回到了华为的财务部门。根据华为官网的介绍，此后，孟晚舟建立了全球统一的华为财务组织，还历任华为国际会计部总监、华为香港公司首席财务官、账务管理部总裁。

1.6观察大鼠脑组织形态

将大鼠4%多聚甲醛灌流后，取脑，用进行固定，然后做石蜡切片，HE染色法对海马进行HE常规染色，观察其CA1区形态改变。

1.7统计学方法

采用SPSS 18.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1 L-NBP对慢性脑缺血大鼠学习记忆的影响

在Morris水迷宫空间探索第6天实验中，撤去平台后让大鼠自由游泳60 s寻找平台，记录大鼠游泳轨迹，系统自动分析计算大鼠在平台所在象限活动时间。模型组在目标象限时间百分比仅为（15.2±5.2）%，与假手术组大鼠［（33.5±4.5）%］比较，差异有高度统计学意义（P＜0.01）。说明慢性脑缺血的大鼠学习记忆能力已经明显下降。然而连续45 d L-NBP治疗后，L-NBP 30 mg/kg组和L-NBP 120 mg/kg组大鼠在目标象限时间百分比分别为（26.3±6.4）%和（28.6±5.8）%，与模型组比较，L-NBP 120 mg/kg组大鼠的记忆能力有所改善（P＜0.01）。

2.2慢性脑缺血大鼠海马CA1区形态变化

HE染色以不同颜色显示细胞质和细胞核，可以清楚地看到细胞的大体形态。本研究中海马CA1区，与假手术组比较，模型组可见神经元皱缩、深染、核不清晰，但程度略轻。连续给药45 d，L-NBP 30mg/kg组轻度改善海马神经元的形态异常。L-NBP 120mg/kg组明显改善海马神经元的形态异常（图1）。表明该药对慢性脑缺血引起海马神经元损伤有保护和治疗作用。

2.3 L-NBP减少了慢性脑缺血大鼠海马β-淀粉样肽含量

大鼠慢性脑缺血3个月后模型组与假手术组比较海马Aβ-42含量显著升高（P＜0.01）。L-NBP 30mg/kg组和L-NBP 120 mg/kg组连续药45 d治疗后均降低了海马的Aβ-42含量，L-NBP 120mg/kg组与模型组比较差异有高度统计学意义（P＜0.01），提示该药减少了Aβ-42在慢性脑缺血大鼠海马表达，且呈一定的剂量依赖性。见表1。

图1　慢性脑缺血海马CA1区神经元（HE染色，400×）

表1　各组慢性脑缺血大鼠海马β-淀粉样肽含量

2.4 L-NBP对慢性脑缺血大鼠海马Tau蛋白磷酸化水平的影响

大鼠慢性脑缺血3个月后，模型组大鼠海马组织Tau蛋白相对含量（1.82±0.23）较假手术组（1.23±0.31）显著升高（P＜0.01）。给药45 d后，L-NBP 30 mg/kg组及L-NBP120 mg/kg组大鼠海马组织磷酸化Tau蛋白［（1.72±0.18）、（1.43±0.35）］较模型组明显降低，L-NBP120 mg/kg组与模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），表明在慢性脑缺血后L-NBP能有效降低海马Tau蛋白磷酸化水平，且呈一定的剂量依赖性。见图2。

图2　慢性脑缺血海马磷酸化Tau蛋白表达水平

3　讨论

随着年龄增长，部分老年人会出现动脉硬化狭窄等心血管相关疾病，使大脑处于持续低灌状态，引起脑毛细血管血流量降低，最后导致近记忆和空间定向力障碍。流行病学调查发现，以长期的慢性脑供血不足引起血管性痴呆占很高的比例［2-3］。

海马的CA1区神经元与动物的学习记忆力密切相关，缺血CA1区对缺血损伤最为敏感，可出现较为严重的神经损害［4］。海马受损后主要是与近期的记忆有关，并且伴有空间定向障碍，本研究在海马CA1区形态学可以观察到L-NBP治疗组可明显的改善了因脑缺血引起的大鼠海马神经元的形态异常。在行为学实验Morris水迷宫采用空间探索，发现慢性脑缺血大鼠的记忆和空间辨别力明显降低，在给予L-NBP治疗后的两个剂量均能不同程度地改善缺陷，并有一定的剂量依赖性。

APP在酶的作用下，形成的多肽片段，Aβ片段通过积聚、沉淀和纤维化具有毒性，其中Aβ1-42更具有破坏力。Aβ产生、降解和清除是一个动态平衡的过程。本实验表明，大鼠脑缺血后Aβ表达增多。已有实验表明在APP突变的转基因鼠Aβ过度表达，进一步的体外实验把Aβ注射入恒河猴的脑皮层，发现引起了TAU蛋白的磷酸化，也导致神经细胞的死亡增加［5-6］。Hernandez等［7］研究表明Aβ激活CDK-5途径通过糖原合成酶激酶-3（GSK-3），使Tau蛋白过度磷酸化。Tau蛋白主要是促进微管的形成，诱导微管成束，保持其稳定性。但TAU蛋白过度磷酸化后导致微管蛋白结合降低丧失导致微管解聚崩解，过度的磷酸化Tau蛋白则自身形成PHF/HFT结构从而发生神经元纤维变性［8-9］，导致微管裂解，神经元营养不良［10］造成临床痴呆症状。同时Aβ过表达能引起多种神经毒性，破坏胞内Ca2+浓度的稳态，诱导氧化应激和上调前凋亡基因bax等［11］。以上各种原因最终导致神经元的调亡，引起临床患者的痴呆症状。这些研究均提示，Aβ量的增加或改变可能是血管性痴呆病理过程启动因素。在本次实验中大鼠脑缺血后3个月，海马的Aβ产量显著升高，同时Tau蛋白磷酸化水平也升高。大剂量的L-NBP给药45 d后，可以显著降低海马的Aβ含量以及Tau蛋白磷酸化水平。这表明L-NBP可以减少了Aβ产量，同时也降低了Tau蛋白磷酸化水平。因此推测，L-NBP改善了脑缺血大鼠学习记忆功能，可以是通过抑制脑缺血后大鼠海马Aβ产量，降低TAU蛋白磷酸化，稳定了微管蛋白最终了保护海马神经元损伤。

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Effect of L-3-N-Butylphthalide on the P-Tau protein level andβ-am yloid peptide content in the hippocam pus of cerebral hypoperfused rats

LUOChao1LU Shuying2PAN Longrui1ZHAOWanhong1▲
1.School of Basic Medicine，Hubei University of Medicine，Hubei Province，Shiyan 442000，China；2.Department of Anesthesiology，Tiefeng Hospital，Hubei Province，Shiyan 442000，China

Objective To investigate the protective effects of L-NBP on the cognitive dysfunction andβ-amyloid peptide content and Tau protein phosphorylation on changes and HE staining morphology of hippocampal neurons in the hippocampus of cerebral hypoperfused rats and explore the possiblemolecularmechanism.M ethods Cerebral ischemic ratmodels were induced by ligating the bilateral common carotid arteries.The rats were divided into four groups of sham group，model group，L-NBP 30 mg/kg group and L-NBP 120 mg/kg group.The sham group and model group were administered oil，and L-NBP 30 mg/kg group and L-NBP 120 mg/kg group were with L-NBP for 45 days，and then，the spatial cognition was spatial probe in Morriswatermaze.HE stainingmorphology of hippocampal neurons and theβ-amyloid peptide content and the expression of phosphorylation Tau protein were detected by biochemicalmethod. Resu lts The time spent percentages in the platform-quadrant in L-NBP 30mg/kg group and L-NBP 120 mg/kg group were（26.3±6.4）%and（28.6±5.8）%，compared with L-NBP 120 mg/kg group and themodel group［（15.2±5.2）%］，the differencewas statistically significant（P＜0.01）；the expression of Aβ1-42 was reduced by the L-NBP，the expression of Aβ1-42 in L-NBP 30mg/kg group and L-NBP 120mg/kg group were（1.07±0.30），（0.99±0.18），compared L-NBP 120mg/kg group and themodel group（1.36±0.24），the differencewas statistically significant（P＜0.01）；Tau protein expression level of L-NBP 30 mg/kg group and L-NBP 120 mg/kg group［（1.72±0.18），（1.43±0.35）］were lower than that of themodel group（1.82±0.23），the difference between the L-NBP 120 mg/kg group and the model group was statistically significant（P＜0.05）.L-NBP could significantly improve protected themorphologicalabnormalities in hippocampal neurons.Conclusion L-NBP can improve the damage of cognition and decreaseβ-amyloid peptide content，thereby reduce phosphorylation of Tau protein levels and improvemorphological abnormalities of hippocampalneurons in the hippocampus of cerebral ischemic rats.

L-3-N-Butylphthalide；β-amyloid peptide；P-Tau protein；Hhippocampus

R74

A

1673-7210（2015）05（a）-0011-04

2014-12-02本文编辑：任念）

湖北省教育厅科研项目（D20102101）；湖北医药学院研究生启动基金项目（2013QDJZR15）；湖北医药学院重点学科建设项目（2014XKJSXJ02）。