护心康对动脉粥样硬化大鼠核转录因子-κB、血管细胞黏附分子-1及单核细胞趋化蛋白-1表达的影响

郭　乐　潘　坤　尹　胜　杨军辉.湖南中医药大学图书馆，湖南长沙4008；.湖南中医药大学实验室，湖南长沙4008；.湖南中医药大学动物中心，湖南长沙4008

护心康对动脉粥样硬化大鼠核转录因子-κB、血管细胞黏附分子-1及单核细胞趋化蛋白-1表达的影响

郭乐1潘坤2尹胜3杨军辉1
1.湖南中医药大学图书馆，湖南长沙410208；2.湖南中医药大学实验室，湖南长沙410208；3.湖南中医药大学动物中心，湖南长沙410208

目的研究护心康对大鼠动脉粥样硬化防治的作用机制。方法采用高脂喂饲及一次性腹腔注射维生素D3复制大鼠动脉粥样硬化模型，将护心康分为低、中、高3个不同剂量组进行干预治疗，通过免疫组化法检测给药后主动脉中核转录因子-κB（NF-κB）、血管细胞黏附分子-1（VCAM-1）及单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）的表达情况。结果护心康低、中、高剂量组均有较好的降低动脉粥样硬化大鼠主动脉中NF-κB、VCAM-1及MCP-1表达的作用（P＜0.01），其中NF-κB、VCAM-1的表达显示出护心康中、高剂量组作用优于低剂量组，差异有统计学意义［NF-κB：（0.236 00±0.015 17）、（0.172 00±0.024 90）比（0.406 00±0.070 21）；VCAM-1：（0.462 00±0.085 56）、（0.410 00±0.047 43）比（0.622 00±0.085 56）］（P＜0.05）。结论护心康具有降低动脉粥样斑块中炎症因子NF-κB、VCAM-1及MCP-1表达的功效，从而抑制大鼠动脉粥样硬化的炎性反应，来达到对动脉粥样硬化的保护作用。

护心康；动脉粥样硬化；核转录因子-κB；血管细胞黏附分子-1；单核细胞趋化蛋白-1；大鼠

动脉粥样硬化是许多心脑血管疾病的基础性病理表现，严重威胁人类健康，冠心病是引起临床上心绞痛、心肌梗死等一系列严重病症的心血管疾病，其主要病理变化涉及的正是供应心肌血液的动脉发生的粥样硬化。而随着我国经济的发展，虽然生活水平提高，但生活方式却并没有优化，运动渐少，压力渐长，饮食不规律，且偏食已成为大多数人的生活常态，我国人群血压、血脂、血糖等心脑血管危险指标均呈上升趋势，例如冠心病的激增，应引起足够重视。近年来随着国内外学者的深入研究，动脉粥样硬化的发病机制也越发清晰，产生了多个新的学说。其中炎性反应学说占据重要的位置，动脉硬化斑块的发生、发展及不稳定性变化均证实与炎性反应有关［1］。本文观察了护心康对动脉粥样硬化大鼠核转录因子-κB（NF-κB）、血管细胞黏附分子-1（VCAM-1）及单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）炎症因子的干预作用。现将实验方法及结果报道如下：

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1动物

清洁级SD大鼠50只，雄性，体重270～290 g。由湖南中医药大学动物房提供，实验动物许可证号：SCXK（湘）2009-0012。

1.1.2药物

护心康片剂由湖南省中医药研究院附属医院制剂室生产，批号为（湘）卫药剂20131104，由瓜蒌壳、茯苓、旋覆花、茜草、生蒲黄、远志、山楂、玉竹等中药精制加工而成，每片含生药0.3 g，粉碎后制备成含生药0.2 g/mL的混悬液。胆固醇、胆酸钠（郑州利伟生物化工厂）；丙基硫氧嘧啶（上海朝晖药业有限公司）；维生素D3注射液（上海通用药业股份有限公司）；市售白糖、猪油。

1.1.3试剂

NF-κB p65，VCAM-1，MCP-1兔源性单克隆抗体由武汉博士德生物工程有限公司提供；二抗：SP-9000免疫组化试剂盒通用型（K122319A）由中山金桥有限公司提供；SP试剂盒由北京中山生物制剂公司生产；显色剂：浓缩型DAB试剂盒（ZLI-9018）由中山金桥有限公司提供。

1.1.4仪器

BX43研究型显微镜奥林巴斯；KD2258轮转式石蜡切片机金迪；TP-8组织摊片机久圣医疗；202型电热恒温干燥箱中兴；Forma Scientific电热恒温培养箱；BCD-222KSA冰箱海尔；微波炉海尔；MI动脉粥样硬化医学图像分析管理系统麦克奥迪。

1.2方法

1.2.1造模

按文献［2］的方法进行造模，每日给予高脂饲料3%胆固醇、0.5%胆酸钠、0.2%丙基硫氧嘧啶、5%白糖、10%猪油、81.3%基础饲料，连续8周，并在喂食高脂饲料前一次性腹腔注射维生素D36×105U/kg，以建立动脉粥样硬化模型。喂养8周后通过随机抽样，经苏木精-伊红（HE）染色观察大鼠主动脉病理解剖，以确认动脉粥样硬化斑块是否造模成功，验证模型复制成功后，将抽样动物及死亡动物分别从相关组的统计学分析中剔除。

1.2.2分组与给药

动物适应性饲养1周后，随机抽取6只为正常组，予以普通饲料喂养。将剩余44只造模动物依据随机数字表进行分组，随机分为四组，分别为模型组、护心康低剂量组、护心康中剂量组、护心康高剂量组，每组11只。用药组依据动物体重，参照动物与人体体表面积折算的等效剂量计算药物具体剂量，实验期间每周称体重，根据体重变化调整给药量。具体分组与用药为：正常组给予蒸馏水灌胃；模型组：从造模后第57天起，蒸馏水灌胃；护心康低剂量组：从造模后第57天起，护心康灌胃给药用量为0.41 g/（kg·d）；护心康中剂量组：从造模后第57天起，用护心康进行治疗，护心康用量为0.81 g/（kg·d）；护心康高剂量组：从造模后第57天起，护心康灌胃给药，用量为1.62 g/（kg·d）。各组每日灌胃体积10 mL/（kg·d），分2次灌胃，连续4周。

1.2.3取材

实验8、12周后，用乌拉坦腹腔注射进行麻醉后，将大鼠面部向上固定于解剖板上，沿腹白线剖开腹腔，并向上剪开胸腔，将心脏暴露。随后一手固定心脏，另一手将灌流针插入左心室，用血管钳夹闭左心室固定灌流针，分别以生理盐水和4%多聚甲醛进行灌注，观察大鼠情况，尾部僵直、肺叶变白时停止灌注，于主动脉瓣至髂动脉分叉处剪断，取主动脉、髂动脉分支处血管。

1.2.4检测项目及方法

1.2.4.1 HE染色病理检测将取材组织用4%多聚甲醛固定，经流水冲洗、脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋后，切片，做HE染色，显微镜下观察病理变化。

1.2.4.2动脉免疫组化检测按免疫组化试剂盒操作要求染色：石蜡切片，常规脱蜡至水。3%双氧水灭活，PBS洗3min共3次，抗原修复，PBS洗3min共3次，滴加封闭液，室温（37℃）孵育20min，倾去，勿洗。滴加1∶100稀释的一抗，37℃孵育2～3 h。PBS洗3 min共3次，滴加生物素化二抗工作液，室温（37℃）孵育20min，PBS洗3 min共3次，滴加辣根酶标记链霉素卵白素工作液，室温（37℃）孵育20 min，PBS洗3 min共3次，DAB显色，自来水洗，苏木精复染，脱水，透明中性树胶封片，显微镜下见细胞浆或细胞核内有棕黄色或棕褐色颗粒即为阳性表达，每张切片选取细胞分布均匀的5个区域于400倍视野镜下观察照像，以MI动脉粥样硬化医学图像分析系统测定其光密度值以进行定量分析，光密度值越高，表示其表达越强。

1.3统计学方法

所有数据经SPSS 16.0软件进行统计学处理。计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，均数间经方差齐性检验后，进行单因素方差分析，多重比较采用LSD-t和Dunnett-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1各组主动脉内膜HE染色病理变化

HE染色切片显示，正常组血管壁层次结构清晰，主动脉壁内膜表面光滑完整，平滑肌排列整齐，无增厚；模型组动脉内膜可见隆起的斑块，病灶表层为大量胶原纤维，有纤维帽的形成，可见炎症细胞的浸润，内膜下有泡沫细胞的聚集，确定大鼠动脉粥样硬化模型建立成功。护心康低剂量组动脉壁斑块厚度相较模型组斑块厚度薄，病灶内可见一定量的泡沫细胞，护心康高、中剂量组斑块厚度较低剂量组进一步降低。见图1（封三）。

2.2护心康对大鼠主动脉VCAM-1、MCP-1、NF-κB蛋白表达的影响

VCAM-1、MCP-1主要表达于动脉内膜，内皮表面阳性着色为棕黄色反应产物沉积，NF-κB蛋白主要表达于细胞浆及细胞间质，五个组比较正常组主动脉染色较浅，呈淡黄色；模型组动脉内膜呈深棕黄色；3个护心康不同剂量组动脉内膜染色呈棕黄色，均较模型组颜色浅。模型组VCAM-1、MCP-1、NF-κB蛋白表达比正常组高，差异有高度统计学意义（P＜0.01），提示造模成功后，粥样斑块中VCAM-1、MCP-1、NF-κB蛋白表达升高。NF-κB在护心康高、中、低剂量组均较模型组低，差异有高度统计学意义（P＜0.01），护心康高、中剂量组较低剂量组有明显降低，差异有高度统计学意义（P＜0.01），护心康高剂量组和中剂量组之间差异无统计学意义（P＞0.05）；VCAM-1在护心康高、中剂量组均较模型组低，差异有高度统计学意义（P＜0.01），护心康低剂量组与模型组之间差异无统计学意义（P＞0.05），护心康高、中剂量组较低剂量组有明显降低，差异有统计学意义（P＜0.01或P＜0.05），护心康高剂量组和中剂量组之间差异无统计学意义（P＞0.05）；MCP-1在护心康高、中、低剂量组均较模型组低，差异有高度统计学意义（P＜0.01），护心康高、中、低剂量组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1、图2（封三）。

表1　护心康对大鼠主动脉NF-κB、VCAM-1及MCP-1蛋白表达平均光密度值的影响（±s）

表1　护心康对大鼠主动脉NF-κB、VCAM-1及MCP-1蛋白表达平均光密度值的影响（±s）

注：与正常组比较，*P＜0.01；与模型组比较，▲P＜0.01；与低剂量组比较，△P＜0.05，◇P＜0.01；NF-κB：核转录因子-κB；VCAM-1：血管细胞黏附分子-1；MCP-1：单核细胞趋化蛋白-1

组别VCAM-1 MCP-1正常组模型组护心康低剂量组护心康中剂量组护心康高剂量组只数6 11 11 11 11 NF-κB 0.130 00±0.014 14 0.550 00±0.114 46*0.406 00±0.070 21▲0.236 00±0.015 17▲◇0.172 00±0.024 90▲◇0.290 00±0.055 23 0.722 00±0.184 17*0.622 00±0.085 56 0.462 00±0.085 56▲△0.410 00±0.047 43▲◇0.118 00±0.029 50 0.370 00±0.062 05*0.260 00±0.080 93▲0.212 00±0.035 64▲0.194 00±0.023 02▲

3　讨论

动脉粥样硬化是动脉壁疾病，是发生在大、中动脉的一种缓慢进展的粥样硬化性疾病，它的特征是循环白细胞的聚集、黏附及跨越，血管内皮细胞转移，伴随着一系列化学因子、细胞因子和生长因子的产生，导致血管壁脂质的形成和纤维组织的损伤［3］。其中的NF-κB、VCAM-1、MCP-1等炎症因子，大量研究都清楚地显示了它们在动脉粥样硬化中的作用及作用方式［4-7］。

MCP-1是具有趋化及活化单核细胞功能的重要细胞因子之一，可聚集单核/巨噬细胞迁移入动脉内皮下层，然后巨噬细胞通过摄取氧化型低密度脂蛋白（oxLDL）形成泡沫细胞，加速动脉粥样斑块的形成。文献报道，MCP-1的过量表达可以加速动脉粥样硬化的进展和泡沫细胞的形成，而MCP-1的缺失可以减缓动脉粥样硬化的进展［4-5］。Martinovic等［6］通过对263例志愿者的研究显示，血浆MCP-1水平升高可以增加冠状动脉粥样硬化的发病风险。

黏附因子是参与细胞间、细胞与细胞外基质间黏附的一系列大分子，其中VCAM-1及细胞间黏附分子-1（ICAM-1）在动脉粥样硬化的形成过程中起着重要的作用，其中VCAM-l早期表达促进了血管内皮的损伤［7］，在进展期则主要通过促进已迁入病灶的单核细胞的滚动、T淋巴细胞的激活，增加细胞间的相互作用及多种细胞因子的释放，促进平滑肌细胞转化和增殖，从而形成纤维斑块，并影响斑块的稳定性。张玉保等［8］研究发现VCAM-1在粥样斑块形成过程中持续表达，提示黏附分子在动脉粥样硬化的早期与进展期均发挥着重要作用。

NF-κB是多种炎性反应相关基因的重要转录调控因子，在动脉粥样硬化的发生和发展过程中，NF-κB可以调节一系列炎症因子的基因的表达，包括MCP-1和细胞间黏附分子-1等的表达，与动脉粥样硬化的炎性反应的放大与持续密切相关。近年来有学者认为，NF-κB是动脉粥样硬化发生的始动机制之一，它可通过调控炎症因子的产生，进而调节白细胞的聚集、泡沫细胞的形成以及影响硬化斑块的稳定性，参与动脉粥样硬化的发生、发展［9］。Benard等［10］报道在动脉粥样斑块中有NF-κB的活化，涉及的病变区域与细胞类型多样，而在血管无粥样斑块的部位则未见或仅见轻微的NF-κB的活化。张玉保等［8］研究显示经相关治疗干预后，动脉粥样硬化病灶中，能抑制NF-κB、VCAM-1的激活与表达，从而有效抑制炎症，且NF-κB及VCAM-1的表达呈正相关，体现了NF-κB的重要调控作用。本研究显示，在动脉粥样硬化组动脉粥样硬化内膜可见VCAM-1、MCP-1、NF-κB的表达明显高于正常组，表明炎症因子NF-κB、VCAM-1、MCP-1参与冠状动脉粥样硬化的形成和发展。

动脉粥样硬化根据其临床表现，中医将其归属于“胸痹”、“心痛”、“真心痛”、“中风”、“痰饮”、“脱疽”等范畴。本病病位在血脉，与肝、脾、肾有关，多为本虚标实。蔡光先教授根据多年的临床经验自拟护心康，其药物组成为丹参、黄芪、瓜蒌皮、薤白、半夏、陈皮、茯苓、蒲黄、茜草、山楂、三七等十余味中药，诸药合用，体现了气、痰、瘀同治，心肝脾共调的整体辨证思路［11-12］。

实验研究表明，护心康能降低高血脂，降低血清和动脉粥样硬化斑块中TNF-α的表达，而抑制由此引发的血管壁炎性反应，从而起到治疗冠心病的作用［11-12］。临床研究也表明，护心康对痰瘀阻络型冠心病、心绞痛有较好的疗效，能有效改善心绞痛的发作症状和心电图表现，降低全血黏度，同时提高患者的生存质量［13-14］。

此次实验显示护心康具有降低粥样斑块中NF-κB、VCAM-1、MCP-1蛋白表达的功效，对VCAM-1、NF-κB的影响，高、中剂量组明显优于低剂量组，体现出剂量上的优势。由此可见，护心康能够抑制斑块内炎性反应，从而稳定动脉粥样硬化易损斑块，并且与剂量有一定的相关性，为护心康应用于临床提供更多有价值的微观研究依据，其进一步的作用机制还在深入研究中。

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Effect of Huxinkang on expression of NF-κB，VCAM-1 and MCP-1 in ratsw ith atherosclerosis

GUO Le1PAN Kun2YIN Sheng3YANG Junhui1
1.Library，Hu'nan University of Chinese Medicine，Hu'nan Province，Changsha 410208，China；2.Laboratory，Hu'nan University of Chinese Medicine，Hu'nan Province，Changsha 410208，China；3.Animal Center，Hu'nan University of Chinese Medicine，Hu'nan Province，Changsha 410208，China

Objective To explore themechanism of Huxinkang（HXK）on prevention of rats with atherosclerosis（AS）. M ethods The ratswere fed with high cholesterol diet and given disposable intraperitoneal injection of vitamin D3to induce themodels，then，they were treated by low，middle and high dose of HXK.The levels of nuclear factor gene binding（NF-κB），vascular cell adhesionmolecule-1（VCAM-1）and monocyte chemoattractant protein-1（MCP-1）on aortic of AS rats were examined by immunohistochemistry in each group.Results All the low，middle and high dose groups could decrease the expression of aortic NF-κB，VCAM-1 and MCP-1 in rats（P＜0.01），and the effects inmiddle and high dose groupswere better than the expression of NF-κB，VCAM-1 in low dose group，the differences were statistically significant［NF-κB:（0.236 00±0.015 17），（0.172 00±0.024 90）vs（0.406 00±0.070 21）；VCAM-1:（0.462 00± 0.085 56），（0.410 00±0.047 43）vs（0.622 00±0.085 56）］（P＜0.05）.Conclusion HXK can decrease the expression of NF-κB，VCAM-1 and MCP-1 of inflammatory cytokines to inhibit the inflammation in aortic tissue of AS rats，so as to achieve the protective effect on atherosclerosis.

Huxinkang；Atherosclerosis；NF-κB；VCAM-1；MCP-1；Rat

R543.3

A

1673-7210（2015）05（a）-0019-04

2014-11-18本文编辑：张瑜杰）

湖南省中医药科研计划项目（60010287）。

郭乐（1985.9-），女，硕士；研究方向：中西医内科学。

杨军辉（1969.4-），男，博士，副教授；研究方向：中医诊断学。