双酚A对秀丽隐杆线虫寿命的影响

孙天琪　曹　峥　张志华　张　妍哈尔滨医科大学，黑龙江哈尔滨150081

双酚A对秀丽隐杆线虫寿命的影响

孙天琪曹峥张志华张妍
哈尔滨医科大学，黑龙江哈尔滨150081

目的研究双酚A（BPA）对秀丽隐杆线虫寿命的影响。方法采用固体培养方式评价0（对照组）、1、10、100、1000μmol/L BPA对线虫寿命的影响（每组各70条）。结果1、10、1000μmol/L BPA对线虫寿命无明显影响，与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。与对照组比较，100μmol/L BPA可延长线虫的寿命（P＜0.05），最长生存时间由15 d延长至17 d，中位生存时间由12 d延长至13 d。结论1、10、1000μmol/L浓度下BPA不会缩短线虫寿命，100μmol/L BPA可以延长线虫寿命。

双酚A；环境雌激素；秀丽隐杆线虫；寿命

双酚A（bisphenol A，BPA），化学名称为2，2-（4，4-二羟基二苯基）丙烷，用于生产碳酸聚酯、环氧树脂、聚苯乙烯树脂以及杀真菌剂、抗氧化剂、染料等，并不断开发新的用途。随着塑料制品的广泛应用，BPA造成严重的环境污染［1］。已有报道证实其可导致各种生物生殖功能下降，生殖器肿瘤，免疫力降低，并引起各种生殖异常和内分泌功能紊乱［2-3］，但是没有确切的文献报道BPA对生物体的寿命是否会有影响。

化合物对寿命作用的研究，一直是科研领域中的热点问题。目前，化合物对机体靶位点的作研究已经具有一定的广度和深度，但是对于整体寿命用的研究还处于相对单一的层面，因此，利用模式生物研究药物对寿命的作用，具有一定的理论和实际意义。本研究利用经典的寿命研究模式生物——秀丽隐杆线虫［4］，在固体培养模式下评价BPA对寿命的作用，并采取多种实验方式，从多方面整体考察BPA是否影响寿命，从而为评估BPA对包括人类在内的高等哺乳动物的寿命影响奠定实验基础。

1　材料与方法

1.1实验对象

野生型（N2）秀丽隐杆线虫，由军事科学院提供。

1.2仪器设备

生化培养箱（SP-02，黄山市恒丰医疗器械有限公司）、体式光学显微镜（SMZ-1500Nikon公司）、生物安全柜（WV-425-600E，NUAIR公司）、高速离心机（Eppendoff公司）、磁力搅拌器（D-79219，Kika-Werke公司）、去离子水机（Tankpe060，Millipore公司）。

1.3药品与主要试剂

BPA（239658-50G）Sigma公司、氯化钠（20121202，天津市北联精细化学品开发有限公司）、蛋白胨（2012329，碧迪医疗器械（上海）有限公司）、琼脂糖（K1001-500g，Am resco公司）、硫酸镁（20121225，天津市巴斯夫化工有限公司）、氯化钙（120831，天津市福晨化学试剂有限公司）、链霉素（0382-5g，Amresco公司）、制霉素（N3503-5MU，Sigma公司）、次氯酸钠（120613，天津市福晨化学试剂有限公司）、氢氧化钠（130103，天津市大陆化学试剂厂）、胰蛋白胨（LP0042，OXOID公司）、酵母提取液（LP0021，OXOID公司）、二甲基亚砜（DMSO）（20140422，天津市永大化学试剂有限公司），磷酸氢二钠（2012708，天津市致远化学试剂有限公司），磷酸二氢钾（120510，西陇化工股份有限公司）。

1.4实验方法

1.4.1主要溶液的配制

1.4.1.1 BPA的配制配制BPA溶液母液浓度分别为：1、10、100、1000μmol/L。溶剂为100%DMSO溶液，保存至4℃冰箱。实验时，将BPA母液1∶1000加入到OP50菌液中，使终浓度为1、10、100、1000μmol/L。对照组母液为不含BPA的溶剂即100%DMSO溶液，实验时将对照组母液1∶1000加入到OP50菌液中。

1.4.1.2 M9缓冲液的配制磷酸氢二钠60 g、磷酸二氢钾30 g、氯化钠50 g、去离子水1 L，将以上溶液高压灭菌后，待温度降至60℃以下后加入1 mol/L硫酸镁1 mL。

1.4.1.3 NGM培养基的配制氯化钠3 g、蛋白胨2.5 g、琼脂糖15 g、胆固醇（溶于无水乙醇，5 mg/mL）1 mL、去离子水1 L，将以上溶液高压灭菌后，待温度降至60℃后加入以下试剂：1 mol/L磷酸缓冲液25 mL，1mol/L硫酸镁1mL，1mol/L氯化钙1mL，200mg/mL链霉素1mL，10mg/mL制霉素1mL。

1.4.1.4大肠埃希菌OP50溶液配制LB溶液50 mL、链霉素（200mg/mL）50μL、OP50原液50μL，将以上溶液静置于37℃生化培养箱中孵育至吸光度值：OD600≈1.2。LB溶液：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠10 g，去离子水1 L。

1.4.2秀丽隐杆线虫同步化

选取有大量妊娠期秀丽隐杆线虫的NGM培养基，用M9缓冲液将秀丽隐杆线虫收集到15mL离心管中，并定容到3.5 mL。加入现配的1.5 m L消化液，混合均匀。剧烈摇晃50次，静置2 min，重复该步骤4～5次，至秀丽隐杆线虫虫体消失为止。将该混合液分装到3个1.5 mL EP管中，室温离心（1300 r/min，离心半径8 cm）1.5min。弃上清，加入1mLM9缓冲液，重悬，室温离心（1300 r/min，离心半径8 cm）1.5min。重复上一步骤两次，加入1mLM9缓冲液，重悬后将液体移入直径为2 cm大小有OP50菌的NGM培养皿中，完成同步化。20℃培养，用于后续实验。同步化消化液：次氯酸钠2 mL，氢氧化钠1mL。

1.4.3秀丽隐杆线虫的固体培养与寿命统计

将同步化后48 h的秀丽隐杆线虫转移到含有0（对照组）、1、10、100、1000μmol/L BPA（1、10、100μmol/L BPA组）的NGM培养基中，每组重复2个平皿，每个平皿35只线虫。在秀丽隐杆线虫的生殖期，每天将秀丽隐杆线虫转移到新培养皿中，直至排卵完成后，隔天将秀丽隐杆线虫转移到新培养皿中，至秀丽隐杆线虫全部死亡为止。若用铂丝针轻轻碰触线虫无反应，则认定线虫死亡、由于阴门破裂死亡和从培养皿中逃逸的线虫记为失踪。

1.5统计学方法

用GraphPad Prism 5软件中的Log-rank（Mantel-Cox）Test方法进行统计，组间比较用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义，并用GraphPad Prism 5软件对结果作图。

2　结果

将同步化后48 h的秀丽隐杆线虫转移到含有0、1、10、100、1000μmol/L BPA的NGM培养基中，观察并记录线虫寿命。结果表明：各组线虫寿命存比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图1。

图1　 5组不同浓度BPA下线虫的寿命

1μmol/L BPA浓度下线虫的寿命与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）（图2）。10μmol/L BPA浓度下线虫的寿命与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）（图3）。100μmol/L BPA浓度条件下，线虫的寿命与对照组比较显著延长，差异有高度统计学意义（P＜0.01）（图4）。100μmol/L BPA处理线虫后，线虫最长生存时间由15 d延长至17 d，中位生存时间由12 d延长至13 d。1000μmol/LBPA浓度下线虫的寿命与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）（图5）。

图2　 BPA浓度为1μmol/L下线虫的寿命

图3　 BPA浓度为10μmol/L下线虫的寿命

图4　 BPA浓度为100μmol/L下线虫的寿命

图5　 BPA浓度为1000μmol/L下线虫的寿命

3　讨论

影响寿命的主要因素有环境因素（如空气、水分、温度）等，饮食因素、疾病因素、遗传因素等［5-6］，而影响衰老的机制有免疫学说、交联学说、内分泌学说等。本研究利用模式生物秀丽隐杆线虫来观察BPA对其寿命的影响。

环境雌激素是环境内分泌干扰物中的一大类，这类物质进人人和动物体内后可模拟细胞内雌激素作用或改变该雌激素活性、干扰内分泌系统的正常功能，通过多种机制表现出拟天然雌激素或抗天然雄激素的作用，其结果可导致生殖功能障碍、生长发育异常、出生缺陷、代谢紊乱和某些与激素有关疾病等［7-8］。作为环境雌激素的BPA，能导致生物体生殖细胞和染色体异常、生殖功能下降、生殖器肿瘤、免疫力降低等［9-11］。因此扩大BPA对人类生殖系统以外的其它系统影响的研究尤为重要，进而更全面地评价BPA对人类健康的影响。

已知人体血清中BPA浓度为0.39～15.9 ng/mL（1.71～69.65 nmol/L）［12］，线虫能从环境中吸收1μmol/L的BPA到体内的量为2×10-6（2μg/g）［13］，相对应于人体血清BPA的含量，因此线虫的给药应为0.86～34.9μmol/L。连续5 d使用罐头食品导致的BPA摄取量可比正常人群的水平高1200%［14］。所以为涵盖正常BPA摄取量和和意外高摄取量，本实验设置BPA的实验浓度梯度为1、10、100、1000μmol/L。

本实验结果显示，本实验浓度下BPA不会使线虫的寿命缩短，反之BPA 100μmol/L组中线虫的寿命有所延长，但与其他药物延寿的作用比较［15-17］，本实验得到的延寿作用并不明显。分析BPA的延寿作用的原因有以下几种可能：①影响雌激素合成，降低生殖能力从而影响寿命；②抑制了氧自由基的产生，改变抗氧化系数；③通过作用于体内的延寿通路，如抑制mTOR通路，IIS通路等［18］，发挥延寿作用。由于秀丽隐杆线虫属于模式生物，为得到进一步更有意义的结果应在哺乳动物上进行后续实验，并应用更多寿命相关指标验证BPA对寿命的影响。

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Effect of bisphenol A on lifespan in Caenorhabditis elegans

SUN Tianqi CAO Zheng ZHANG Zhihua ZHANG Yan
Harbin Medical University，Heilongjiang Province，Harbin 150081，China

Objective To study the effect of bisphenol A（BPA）on the lifespan in Caenorhabditis elegans（C.elegans）. M ethods Solid culture was used to evaluate the effect of 0（control group），1，10，100，1000μmol/L BPA on the lifespan in C.elegans（with 70 in each group）.Results 1，10，1000μmol/L BPA had no significant effect on the lifespan of C.elegans，compared with control group，the differences were not statistically significant（P＞0.05）.Compared with control group，100μmol/L BPA extended the lifespan of C.elegans（P＜0.05），the longest survival time from 15 d extended to 17 d，the median survival time from 12 d extended to 13 d.Conclusion 1，10，1000μmol/L BPA do not shorten the lifespan in C.elegans，100μmol/L BPA can extend the lifespan of C.elegans.

Bisphenol A；Environmental estrogens；Lifespan；C.elegans

Q75

A

1673-7210（2015）05（a）-0004-04

2014-12-14本文编辑：苏畅）

国家自然科学基金青年科学基金项目（81100072）。

孙天琪（1990.8-），女，哈尔滨医科大学药理学专业2013级在读硕士研究生；研究方向：药理学。

张妍（1973.6-）女，博士，教授；研究方向：心血管药理学、新药研发。