观叶福禄桐遗传多样性的ISSR分析

张国武刘学锋周兴华黄涛

（1.国家林业局桉树研究开发中心，湛江 524022；2.余干县林业局，余干 335100；3.江西农业大学园林艺术学院，南昌 330045）

观叶福禄桐遗传多样性的ISSR分析

张国武1刘学锋1周兴华2黄涛3

（1.国家林业局桉树研究开发中心，湛江 524022；2.余干县林业局，余干 335100；3.江西农业大学园林艺术学院，南昌 330045）

利用ISSR分子标记对9个观叶福禄桐品种进行遗传多样性和亲缘关系分析，从100条引物中筛选出9条稳定、多态性高的引物用于PCR扩增，共获得70条带，其中多态性条带61条，多态百分率为87.14%。聚类结果显示，品种间相似性系数为0.346 9-0.816 3，聚类结果与品种间的地理来源紧密相关，从外观形态上比较，亲缘性较近的叶形和株型相似性较高；观叶福禄桐各品种间基因型差异较小，亲缘关系较近，遗传基础相对较窄。

ISSR；福禄桐；观叶植物；遗传相似性系数；聚类分析

ISSR（Inter-simple sequence repeat）由Zietkiewicz等［1］于1994年创建，因其具有分布广、多态性高、技术难度低、操作简单、重复性高、成本低等优点，是一种近年来应用较为广泛的分子遗传标记技术，它来源于植物基因组中丰富的简单序列重复（SSR），由2-4个随机的核苷酸锚定在微卫星序列的3'端或5'端，由此组成的单引物进行重复序列间DNA的PCR扩增［2］，现已普遍应用于居群生物学的研究、品种鉴定和物种分类，并作为构建遗传图谱的工具［3］。

福禄桐（Polyscias），原产于太平洋诸岛，为五加科福禄桐属植物，常绿灌木或小乔木，株形柔和，古朴优雅，古色古香，叶片与茎干奇特优美，侧枝细长，枝繁叶茂，叶片形状多样，有圆叶、羽叶、条形叶、蕨叶等［4，5］；叶色斑驳多彩，有绿、黄、银色等；植株多分枝，分枝皮孔显著，树型紧凑优美，生长速度快，耐整形修剪，性喜高温多湿，耐旱耐阴。不同规格的植株装饰客厅、卧室、书房、阳台等处，既时尚典雅，又清新自然，是近几年较为流行的高档室内观叶盆栽，适合庭院美化和室内盆栽。目前，国外的研究主要集中在观叶福禄桐的起源、化学成分及药理作用方面［6-8］；国内则主要集中于研究观叶福禄桐的栽培、繁殖和观赏价值［9-11］，而对其遗传多样性和品种间亲缘关系的研究国内外尚未报道，由此导致观叶福禄桐品种混杂、分类标准不统一、优良种质资源稀缺，制约了其快速良好的发展。因此，本研究在广泛调查和收集福禄桐品种资源的基础上，以国内常见的观叶福禄桐为试验材料，利用ISSR分子标记对品种间的亲缘关系和遗传相似性进行分析，旨在为福禄桐属植物的分类、亲缘关系鉴定提供依据，同时为今后福禄桐种源的选择、优良品种的引进和新品种培育奠定分子生物学研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料

9个参试福禄桐品种由广东省湛江市国家级南方种苗基地所提供（参试品种详见表1），试验于国家林业局桉树研究开发中心实验室内完成。

表1 福禄桐属植物9份材料

1.2 方法

1.2.1 福禄桐基因组DNA的提取与检测 试验样品均采集生长健壮、无病虫害危害植株的幼嫩叶片，利用改良的CTAB法［12-14］提取福禄桐叶片基因组DNA，用1×TAE电泳缓冲液，在1.5%琼脂糖（含EB终浓度为0.5 μg/mL）凝胶中电泳，条件为85 V，50 min；凝胶成像系统下（Bio-Rad）观察并记录，以初步检测基因组DNA的完整度和质量；通过核酸检测仪（Bio-Rad生产的Thermo Nano Drop 2000）检测其浓度及纯度。

1.2.2 PCR反应体系及条件 PCR扩增仪为美国Bio-Rad（伯乐公司）C-1000，反应体系：反应体系总体积为25 μL，DNA模板浓度为15 ng，Mg2+浓度为3.0 mmol/L，引物浓度0.6 μmol/L，Taq酶含量0.5 U，dNTP浓度为0.20 mmol/L，内含2.5 μL 10×PCR buffer。反应程序：94℃预变性4 min；94℃变性45 s，47℃退火50 s，72℃延伸1 min，循环38次；72℃延伸7 min；4℃保存。

1.2.3 引物筛选及PCR扩增 本研究的引物由铂尚生物技术（上海）公司合成，随机选择3个参试材料对100条引物进行筛选，从中选出差异性条带强、多态性高的引物用于后续的PCR扩增；利用筛选的引物对所有参试样品DNA进行PCR扩增，扩增结束后取PCR扩增产物和Loading buffer缓冲液比例为2∶1于1.5%琼脂糖（含EB终浓度为0.5 μg/mL）凝胶中电泳（85 V，1 h），然后在凝胶成像系统下观察并成像记录。

1.2.4 电泳图谱分析方法 对PCR扩增好的图谱带进行统计分析，每个电泳图扩增出的条带代表一个ISSR位点，有条带的记为“1”、无则记为“0”的方法记录每个引物PCR扩增的电泳谱带，且仅记录清晰、稳定、重复性好的扩增条带，并将“0”、“1”数据转换成Excel表格格式，再利用NTSYS-pc2.10软件做进一步分析；在NTSYS-pc2.10软件中，根据SM相似系数法求得9个福禄桐品种间遗传相似性矩阵，用UPGMA法对各品种进行聚类分析，构建聚类图；再将Dice遗传相似性矩阵进行Dcenter数据转化，求其特征量和特征向量，进行主坐标分析。

2 结果

2.1 基因组DNA提取的质量

采用改良的CTAB法提取9个福禄桐品种的基因组DNA，电泳检测结果如图1所示，核酸检测仪测定OD260/OD280比值在1.75-1.95之间，表明所提取叶片基因组DNA中蛋白质和RNA含量较少，纯度较高，符合后续的试验要求。

图1 九个福禄桐品种DNA质量

2.2 引物筛选多态性分析

随机选择3个试验样品对100个ISSR引物进行筛选，共筛选出9条清晰、稳定、多态性高的引物用于PCR扩增（表2）；利用筛选出的9条多态性引物对9个不同品种的福禄桐进行PCR扩增，扩增结果见图2。通过对9张图谱的统计分析，PCR扩增共得到70条带，其中多态性条带61条，多态百分率为87.14%；其中引物U848扩增条带数最多，共产生11条，多态性条带9条，引物U823、U826多态性百分比达到100%，都扩增出7条带，引物U859扩增条带数最少为6条；各引物扩增条带为6-11，大小一般在200-3 000 bp之间。检测结果见表2。

表2 ISSR-PCR分析所用引物及扩增结果

2.3 品种间遗传相似性分析

利用NTsys-pc2.10软件得出各观叶福禄桐品种间的相似性系数。结果（表3）表明，9个观叶福禄桐品种间的遗传相似性系数范围在0.346 9-0.816 3，平均遗传相似性系数为0.598 4；其中C1（圆叶福禄桐）和C5（黄斑圆叶福禄桐）间的遗传相似性系数最大，达到0.816 3，其次C1（圆叶福禄桐）和C2（红叶圆叶福禄桐）遗传相似性系数也较高，达到0.795 9，表明它们之间的遗传差异小，亲缘性很近，而C2（红叶圆叶福禄桐）和C7（南洋参）相似性系数最小为0.346 9，表明其遗传差异性较大，亲缘关系最远。

表3 九个观叶福禄桐品种间的相似性系数

2.4 品种间聚类分析

图2 不同引物的PCR电泳图谱（编号C1-C9同表1）

根据遗传相似性系数矩阵采用UPGMA法对9个观叶福禄桐品种进行聚类分析（图3）。分析聚类图可知，在遗传相似性系数为0.52处，9个观叶福禄桐品种分为A、B两大类，A类有7个品种，C4（羽叶福禄桐）和C7（南洋参）归为B类，相似性系数达到0.76，这两品种间形态特征也极为相似，都为羽叶，只是叶片开裂的深浅程度不同而已，种质资源收集地也都来自广西，可见地域差异也影响着品种间的亲缘性，聚类结果显示C4（羽叶福禄桐）和C7（南洋参）亲缘性较近；A类种群在相似性系数0.57处，分支成A1和A2两亚类，A2亚类只有C3（线叶福禄桐）一个品种，而A1亚类在相似性系数为0.63处，又分支成A11和A12两组，A11组包括C1（圆叶福禄桐）、C5（黄斑圆叶福禄桐）、C2（红叶圆叶福禄桐）和C9（银边圆叶福禄桐），其叶形和叶脉极相似，叶色稍有差异，其中C1（圆叶福禄桐）和C5（黄斑圆叶福禄桐）亲缘性最近，相似性指数约为0.82；A12组有银边福禄桐和芹叶福禄桐。

图3 福禄桐品种资源ISSR聚类图

2.5 品种资源的主坐标分析

品种资源的主坐标分析和聚类分析虽然都能反应样品的聚类情况，但它们反应的信息含量却有所差异。从主坐标二维分布图（图4）可以得知，9个福禄桐品种有较明显的分布区域，C4和C7位于坐标图的左侧，C6和C8分布于坐标图的上方，C1、C2、C5和C9分布于坐标图的右下方。从整体上看品种资源的主坐标分析与聚类分析结果较符合。

图4 福禄桐品种资源主坐标分析二维图

3 讨论

ISSR是在SSR的基础上发展起来的一种新型的分子标记，目前，ISSR已广泛用于植物品种鉴定、遗传作图、遗传多样性及分子生态学研究［15，16］。本研究利用ISSR分子标记技术对9份观叶福禄桐种质资源材料进行遗传多样性分析，从100条引物中筛选出9条稳定、多态性高的引物用于PCR扩增，共获得70条带，其中多态性条带61条，多态百分率为87.14%，体现了ISSR分子标记较好的多态性；遗传多样性分析将9个福禄桐品种完全分开，揭示了不同福禄桐品种间的相互关系，是鉴定福禄桐种质资源亲缘关系的一条有效途径。

研究结果显示，9个观叶福禄桐品种间相似性系数为0.346 9-0.816 3，品种间具有较高遗传相似性；聚类分析显示：各品种间相似性系数为0.52时，其中羽叶福禄桐和南洋参聚为B组，其它的福禄桐品种聚为A组，各福禄桐属植物亲缘关系分化比较明显，植株的外部形态特征相似度与其亲缘关系远近大部分相对应，其中银边福禄桐与芹叶福禄桐亲缘关系近，两植物外形特征差异明显，其它福禄桐属植物归为同一类的外形特征都较为相似。进一步分析聚类图可知，福禄桐属植物遗传背景范围小，可推测出种源相对少，单一。聚类结果与品种间的地理来源紧密相关，从外观形态方面比较，亲缘性较近的叶形和株型存在一定的相似度，由于本研究表型性状调查采集的数据较少，聚类结果与表型性状间相关性并不明显，今后可在大量调查、采集福禄桐表型性状数据基础上，对其表型性状进行深入分析，通过与聚类分析结果相比较，找到能对福禄桐品种进行有效分类或鉴别的质量性状。

福禄桐原产于太平洋诸岛，由于气候和环境因素的限制，只在我国南部的部分沿海城市引种和栽培，栽培面积狭窄，人工驯化栽培时间较短暂，而且长期以来福禄桐的繁殖方式以扦插繁殖为主，因而差异性不大；又因国内各地方引种、栽培和育种只限于当地市场好、受欢迎的品种，地域性差异，育种目标单一，导致国内福禄桐各品种间基因交流少，基因多样性逐渐窄化，所以国内福禄桐各品种间亲缘关系较近，各品种间的遗传多样性并非那样丰富。在今后的驯化、栽培和育种工作中，加大引种、推广力度，促进不同产区、种间种质资源的交流，丰富其遗传多样性，加大对优良新品种的选育力度，促进观叶福禄桐生产的持续发展。

4 结论

本研究通过改良的CTAB法提取福禄桐属植物DNA，获得纯度高、质量好的基因组DNA，符合后续的试验标准；利用优化的反应体系对试验所设计的引物进行筛选，获得9条试验所需引物，分别对9个不同福禄桐属植物基因组DNA进行PCR扩增，共获得70条带，其中多态性条带61条，多态百分率为87.14%；然后分别对PCR图谱带进行聚类分析，结果表明：9个观叶福禄桐品种间相似性系数为0.346 9-0.816，各品种间相似性系数为0.52时，其中羽叶福禄桐和南洋参聚为B组，其它的福禄桐品种聚为A组，各福禄桐属植物亲缘关系分化比较明显；最后对9个福禄桐属植物进行主坐标分析，其结果与聚类分析基本保持一致。

［1］Zietkiewicz E， Rafalski A， Labuda D. Genome fingerprinting by simple sequence repeat（SSR）-anchored polymerase chain reaction amplification［J］. Genomics， 1999， 20：176-183.

［2］杨兆起.中药鉴别手册（第3册）［M］.北京：科学出版社，1994：1.

［3］张国武， 钟文斌， 乌云塔娜， 等.油茶优良无性系［J］.林业科学研究， 2007， 20（2）：278-282.

［4］胡松华.南洋森与福禄桐观叶植物介绍［J］.花卉， 2006， 9：32.

［5］胡一民.简约时尚的观叶植物—福禄桐［J］.中国花卉盆景，2003， 3：24.

［6］Plunkett GM， Lowry PP II， Michele K. The phylogenetic status of Polyscias（Araliaceae）based on nuclear its sequence date［J］. Annals of the Missouri Botanical Garden， 2001， 30（1）：213-230.

［7］Mitaine-Offer AC， Tapondjou LA， Lontsi D. Constituents isolated from Polyscias fulva［J］. Biochemical Syetematics and Ecology，2004， 32（6）：607-610.

［8］Vo DH， Yamamura S， Ohtani K， et al. Oleanane saponins from Polyscias fruticosa［J］. Phytochemistry， 1998， 47（3）：451-457.

［9］李克烈， 王荣香， 陈伟， 等.羽叶南洋参的组织培养［J］.植物生理学通讯， 2007， 43（2）：324.

［10］欧阳泉， 周俊辉， 陈水渐， 等.几种盆栽植物对甲醛的净化作用［J］.北方园艺， 2012（22）：57-60.

［11］ 尹斌开， 龙相斌， 胡庆， 等.圆叶福禄桐组培快繁技术研究［J］.现代农业科技， 2008（20）：18-19.

［12］ 邹喻苹， 葛颂， 王晓东.系统与进化植物学中的分子标记［M］.北京：科学出版社， 2001.

［13］ Dolye JJ， Dolye JL. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue［J］. Phytochem Bul， 1987， 9（1）：11-15.

［14］ 许永华， 张爱华， 金慧， 等.人参种源遗传关系的ISSR分析［J］.中草药， 2010， 41（7）：1164-1167.

［15］闫伟红， 徐柱， 李临杭， 等.冰草属植物ISSR遗传分析与评价［J］.华北农学报， 2010， 25（增刊）：60-64.

［16］苏亚蕊， 刘新浩， 李锁平.棉花种质资源多样性的ISSR聚类分析及主成分分析［J］.河南大学学报：自然科学版， 2012，42（4）：401-406.

（责任编辑 马鑫）

Studies on the Genetic Diversity of Polyscias by ISSR Marker

Zhang Guowu1Liu Xuefeng1Zhou Xinghua2Huang Tao3
（1.China Eucalypt Research Centre，Zhanjiang 524022；2. Yugan County Forestry Bureau，Yugan 335100；3. College of Landscape and Art，Jiangxi Agricultural University，Nanchang 330045）

In this study， nine species Polyscias leaves as experimental material， we analyzed the genetic diversity and relationship by ISSR markers， 9 stable and high polymorphism ISSR primers screened from 100 ISSR primers by optimized the system of PCR for Polyscias， a total of 70 bands were obtained by the polymorphic primers of 9 test specimens， including 61 polymorphic bands， the polymorphic percentage was 87.14%. The genetic similarity coefficients ranged from 0.346 9 to 0.816 3， suggesting that the substantial genetic divergence between some varieties. The clustering scheme showed that Polyscias had small differences of genetypes their genetic basis was comparatively narrow.

ISSR；Polyscias；foliage plants；genetic similarity coefficient；cluster analysis

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.01.017

2014-04-29

中国林科院院基金项目（CAFYBB2012005）

张国武，男，博士，高级工程师，研究方向：森林培育；E-mail：fyzgwu@163.com

黄涛，男，硕士研究生，研究方向：园林植物栽培与应用；E-mail：htaovs2010@163.com