响应面法优化香菇多糖的超声辅助提取工艺

万阅齐计英曾红韩阳韩静

（1.沈阳药科大学制药工程学院，沈阳 110016；2.辽宁中医药大学药学院，沈阳 110032）

响应面法优化香菇多糖的超声辅助提取工艺

万阅1齐计英1曾红1韩阳2韩静1

（1.沈阳药科大学制药工程学院，沈阳 110016；2.辽宁中医药大学药学院，沈阳 110032）

为了开发利用香菇资源，采用超声辅助法提取香菇中的多糖，利用响应面法优化超声辅助提取法提取香菇多糖的工艺条件。首先进行单因素试验考察，在单因素试验的基础上，选择超声波功率、超声时间及料液比为自变量，以多糖得率为响应值，采用Box-Benhnken法设计3因素3水平响应面设计试验。结果表明，响应面模型与实际情况拟合良好，能较好地预测香菇多糖得率。最佳工艺：超声波功率300 W、超声波处理时间25 min、料液比1∶30，多糖得率25.71%，与理论值（25.55%）相比，相对误差较小，为0.63%。与传统热水浸提法比较，超声波提取法多糖得率较高，且耗时少，是理想的香菇多糖提取方法。

热水浸提；超声辅助提取；多糖得率；响应面优化；单因素试验

DIO： 10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.01.012

香菇多糖（Lentinan）是从香菇中提取的有效活性成分。现代医学及营养学等各领域对其不断深入研究，香菇多糖的药用价值也不断被发掘。研究表明香菇多糖的活性成分β-（1-3）-D葡聚糖对抑制异源、同源，甚至遗传性的肿瘤都有效，且毒副作用小［1］。香菇多糖也具有抗病毒、增强人体免疫力等功能，在食品、药品、保健品等方面具有广阔的前景［2］。超声波辅助提取技术是利用超声波粉碎技术，使生药中心粒径在5-10 μm以下，细胞破壁率达到95%，药效成分易于提取也易于人体吸收这种新技术的应用，不仅适用于各种质地不同的药材，而且可使其中有效成分直接暴露出来，从而使药材成分的溶出和起效更加迅速完全。与传统提取方法相比，具有效率高，能耗低等特点［3］。

目前已报道的香菇多糖提取包括各种提取方法及各种因素对其得率的影响，已有的模型也只是单因素对其多糖得率的影响，各因素之间的交互作用的报道较少。本试验采用响应面法［4］进行试验设计、数据分析，考察超声波功率、超声时间、提取温度3个因素的交互作用对香菇多糖得率的影响，旨在为香菇多糖在食品、药品领域的发展提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

干香菇（市售）、葡萄糖、苯酚、浓硫酸、无水乙醇等均为分析纯。

RRHP200型万能高速粉碎机：欧凯莱芙（香港）实业公司；jy92-2d型超声波细胞粉碎机：宁波新芝生物科技股份有限公司；电子天平：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；df-101s集热式恒温磁力搅拌器：巩义市予华仪器有限公司；80-2型离心沉淀机：姜堰市新康医疗器械有限公司；uv2800pc型紫外可见分光光度计：尤尼科仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 工艺流程 干香菇→粉碎→香菇粉末→超声辅助提取→离心（3 000 r/min）→取上清液→定容，测量吸光度→计算香菇多糖得率。

1.2.2 标准曲线的绘制 取105℃烘干至恒重的葡萄糖2.5 g定容于50 mL容量瓶中，配成50 mg/mL的葡萄糖标准溶液。精密移取葡萄糖标准溶液0、1、2.5、4、5.5和7 mL定容于50 mL容量瓶中配制成0.02、0.05、0.08、0.11和0.14 mg/mL葡萄糖溶液。分别移取上述葡萄糖溶液2 mL，加入6%苯酚溶液1 mL，迅速加入浓硫酸5 mL，震荡摇匀，沸水浴加热15 min，冷却30 min，测定490 nm处溶液的吸光值。得标准曲线回归方程为：y=7.81x-0.081 6，R2=0.994 5。

1.2.3 香菇多糖含量测定 试验采用苯酚-硫酸法进行香菇多糖含量测定。具体步骤如下：取2 mL香菇多糖提取液置20 mL具塞玻璃试管中，向溶液中加入1.0 mL 5%苯酚溶液，然后快速且与液面垂直加入5 mL浓硫酸，涡旋震荡，将试管置于30℃水浴加热20 min，在紫外分光光度计490 nm处测量吸光度。将吸光值带入标准曲线方程，计算得香菇多糖浓度。再将多糖浓度带入下式计算得香菇多糖得率。

其中，C是测得吸光度对应的浓度，V是提取液的体积，m是原料干重。

1.2.4 单因素试验 按工艺流程方法提取香菇多糖，选取超声波功率（100、200、300、400和500 W）、超声时间（10、15、20、25、30、35和40 min、）、料液比（1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50）以及反应温度（40℃、50℃、60℃、70℃和80℃）几个因素进行单因素试验，以香菇多糖得率为考察指标，探究各因素对香菇多糖得率的影响。

1.2.5 响应面试验设计 在单因素试验的基础上，选取超声波功率、超声时间、料液比为自变量，多糖得率为响应值，进行3因素3水平响应面分析，采用 Box-Benhnken法对香菇多糖的提取工艺进行优化。试验因素水平设计表，见表1。

表1 因素和水平Box-Benhnken设计表

2 结果

图1 超声波功率对香菇多糖得率的影响

2.1 单因素试验结果

2.1.1 超声波功率对香菇多糖得率的影响 超声波功率对香菇多糖得率的影响（图1）表明，随着超声功率的增大，香菇多糖得率增大，在 300 W时多糖得率出现最大值。但超声功率继续增大，香菇多糖得率反而降低。因此选择超声功率为300 W进行响应面优化试验。

2.1.2 超声时间对香菇多糖得率的影响 超声时间对香菇多糖得率的影响（图2）表明，随着超声时间的延长，香菇多糖得率呈现逐渐增大的趋势，超过25 min后，多糖得率逐渐下降，在25 min时出现最大值。图2显示，超声时间为20 min所对应的多糖得率与25 min所对应的最大值相差不大，考虑到超声波所产生的耗费问题，选择超声时间为20 min进行响应面优化试验。

图2 超声时间对香菇多糖得率的影响

2.1.3 料液比对香菇多糖得率的影响 液料比对香菇多糖得率的影响（图3）表明，随着液料比的增加，香菇多糖得率呈现逐渐增大的趋势，在液料比为30∶1处，多糖得率趋于平缓。考虑到节约原料的问题，选择液料比为30∶1进行响应面优化试验。

图3 液/料比对香菇多糖得率的影响

2.1.4 反应温度对香菇多糖得率的影响 反应温度对香菇多糖得率的影响（图4）表明，随着反应温度的升高，香菇多糖得率呈现先增大后减小的趋势，在温度为60℃时，多糖得率出现最大值，但图4显示，各温度所对应的多糖得率最大值与最小值间相差不大，因此选择反应温度为60℃进行试验，但不选择反应温进行响应面优化试验。

图4 反应温度对香菇多糖得率的影响

2.2 响应面优化试验结果

2.2.1 响应面试验设计及结果 根据Box-Benhnken法设计原理，在单因素试验基础上，选取超声波功率、料液比、超声时间为自变量，香菇多糖得率为响应值，进行3因素3水平响应面试验设计。根据软件设计，香菇多糖提取条件的优化试验共有17组，试验设计及响应值结果如表2所示。

表2 响应面试验设计及结果

2.2.2 数学模型的建立和数据分析 根据所得试验数据采用软件Design-Expert 7.1.3进行多元回归拟合，得到多糖得率（Y）对试验因素的二次多项回归方程：

方程中各项系数绝对值的大小直接反映各因素对响应值的影响程度，系数的正、负反映了影响的方向［5］。 由于方程的二次项系数均为负值，可以推断方程代表的抛物面开口向下，因而具有极大值点，可以进行优化分析［6］。由方程的一次项系数可以得出，影响超声波辅助提取法的香菇多糖得率的因素的主次顺序为：超声时间，料液比，超声功率。

对模型进行方差分析，结果（表3）显示，方程的模型显著性P＜0.000 1，是极显著的，说明模型有意义；失拟差＞0. 05，不显著，即模型与试验值的差异较小说明该模型能解释97.70%的响应值的变化；相关系数R2=0.989 9＞0.9，说明该模型拟合程度良好，预测值与实测值之间有较好的相关性，试验误差较小，可以用回归方程代替试验真实点对试验结果进行分析和预测［7］。表中一次项、交互项和二次项中都有显著性因素。一次项A、C达到极显著水平，B达到显著水平；交互项AC、BC达到显著水平；二次项A2、B2达到极显著水平，C2达到显著水平。从表中各因素的F值和P值可知，超声时间对香菇多糖得率的影响最大；其次是料液比和超声功率。

表3 回归分析表

2.2.3 响应面分析图 根据回归方程建立响应曲面图，考察响应曲面形状，分析超声波功率、料液比、超声时间对响应值香菇多糖得率的影响。各因素之间的交互作用对香菇多糖得率影响的响应面图如图5-7所示。图中能够看出多糖得率（Y）随超声时间的加长而先增大后减小，在中心点处出现峰值。料液比的改变也会不同程度的影响多糖得率（Y）的变化，而超声功率对多糖得率（Y）的影响相对不明显。响应曲面的坡度的陡峭程度说明随着影响因素的变化，其对应响应值的变化情况。而等高线的形状可反映出交互效应的强弱，椭圆形表示两因素交互作用显著，而圆形则与之相反［8］。

由图5可知，响应曲面陡峭，表明料液比和超声时间的交互作用对香菇多糖得率影响较大。从等高线形状可以看出，超声时间对多糖得率的影响要大于料液比。

由图6可知，响应曲面较陡峭，表明超声波功率和超声时间的交互作用对香菇多糖得率影响较大。从等高线形状可看出，超声时间对多糖得率的影响要大于超声波功率。

由图7可知，响应曲面也较陡峭，表明超声波功率和超声时间的交互作用对香菇多糖得率影响也较大。从等高线形状可看出，料液比对多糖得率的影响要大于超声波功率。

综上所述，超声时间对香菇多糖得率的影响最大；其次是料液比和超声波功率［9］。

图5 料液比和超声时间的相互影响及等高线分析图

图6 超声波功率和超声时间的相互影响及等高线分析图

图7 超声波功率和料液比的相互影响及等高线分析图

2.2.4 优化提取参数和验证模型 通过响应面试验分析，确定超声波辅助提取法提取香菇多糖最佳因素水平为：超声时间25 min，料液比1∶30，超声功率300 W，香菇多糖得率的最大预测值为25.55%。在上述条件下，进行3组验证性试验，结果见表4。

表4 超声波提取法的验证试验结果

经验证，实测值与预测值之间拟合较好，误差在允许范围内，说明利用响应面法对热水浸提法和超声提取法提取香菇多糖的结果分析是可行、有效的［10］。

2.3 超声波辅助提取法与传统方法的比较

由单因素试验和响应面优化试验结果可知，热水浸提法提取香菇多糖的最佳工艺条件为：料液比1∶17.5、提取时间3 h、提取温度80℃，在此条件基础上，进行响应面优化试验，结果得香菇多糖得率为20.57%。超声波辅助提取法与热水浸提法提取香菇多糖的比较（表5）表明，超声辅助提取法与传统的热水浸提法相比，香菇多糖得率具有明显提高的同时，其提取时间和反应温度均有减小，因此超声波辅助提取法较传统提取方法更有优势，既节约了原料，又减少了能耗。

表5 超声辅助提取与传统热水浸提法的比较

3 讨论

本研究首先考察了香菇多糖的单因素试验，然后以香菇多糖得率为指标，对超声提取过程中影响香菇多糖提取的超声功率、超声时间和液料比3个因素，采用中心组合（Box-Behnken）试验设计及响应面分析，建立回归模型。通过分析各因素的显著性和交互作用，优化得到香菇多糖超声提取的最优工艺参数。

单因素试验中，多糖得率随超声功率、超声时间、料液比和温度的变化趋势均为先升高然后下降。温度的升高，有利于增加溶剂的渗透能力，加快香菇多糖从细胞向外扩散的速率，使得多糖得率升高。温度过高，会破坏多糖的结构影响其生物活性；同时高温提取对工业化生产的设备也提出严格要求［11］；超声功率的逐渐增大，多糖得率也随之加大，这是因为超声波的机械剪切作用加强，香菇粉末的细胞破坏更充分，有助于多糖从细胞中溶出。超声功率在300-500 W间，多糖得率下降，主要因为当超声功率大于300 W时，超声作用进一步加速了提取液的流动，减少了物料在超声场中的停留时间，破壁作用也就随之减弱，同时超声波的剪切作用也会在一定程度上破坏香菇多糖的结构，从而影响多糖得率［12］；在一定时间内，香菇多糖随时间的延长而不断被溶解出，超声时间愈长，多糖得率越高。但扩散达到平衡后，超声时间过长，香菇多糖得率反而降低，这是因为超声波具有较强的机械剪切作用，长时间的作用会使大分子的多糖断裂，从而损失增大而影响多糖得率［13］；随着液料比的增大，香菇多糖得率增加，但当液料比超过一定范围后，多糖得率增加的不再明显。这是因为对于一定量的香菇粉末来说，溶剂用量的增加，增加了原料与溶剂接触界面的浓度差，从而提高了香菇多糖与溶剂的扩散速度，多糖得率增大。溶剂量太多，颗粒细胞内的蛋白质等物质析出，降低了提取液的固形物含量，不利于以后的分离，且加重了工业生产中后续工艺［11］。

试验结果表明，超声波法的多糖得率高于传统热水浸提法，且超声波提取法具有快速、节能、操作简便、不改变香菇多糖原有性质等优点。尤其是提取时间可以缩短5倍，是工业生产中有价值的提取工艺。与以往香菇多糖提取的相关研究［14］相比，本试验超声辅助提取法提取香菇多糖的提取时间短，能耗小、提取剂用量少、香菇多糖得率高。

4 结论

通过Box-Behnken的中心组合设计及响应面（RSM）分析，建立超声提取香菇多糖的二次多项式数学模型。经检验证明该模型是合理可靠的，能够较好地预测香菇多糖得率。利用模型的响应面及其等高线，对影响香菇多糖得率的关键因素及其相互作用进行探讨，通过典型分析并考虑到实际操作的便利性得到的最佳工艺条件为：超声时间25 min、料液比1∶30、超声功率300 W，在此优化条件下，香菇多糖得率的理论值为25.55%。为了进一步验证响应面分析法的可靠性，采用上述最优条件进行3次，测得超声提取香菇多糖的验证试验，香菇多糖得率分别为：25.52%、25.92%和25.69%，其平均值为25.71%，与理论值（25.55%）相比，相对误差较小，为0.63%。经中心组合（Box-Behnken）试验设计及响应面分析优化后，多糖得率平均值比传统法热水浸提法提高了5%左右。

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（责任编辑 狄艳红）

Optimization of Ultrasonic Assisted Extraction of Lentinan by Response Surface Methodology

Wan Yue1Qi Jiying1Zeng Hong1Han Yang2Han Jing1
（1. College of Pharmacy Engineering，Shenyang Pharmaceutical University，Shenyang 110016；2. College of Pharmacy，Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110032）

Technological conditions of extraction of Lentinan with ultrasonic extraction are optimized for developing and utilizing the resource of Mushrooms by using the response surface method（RSM）. Firstly， single factor experiment was investigated， and then based on single factor experiment， a 3-factor， 3-level Box-Benhnken experiment was designed， in which ultrasonic power， ultrasonic time and the ratio of solid to liquid were chosen as influencing factors， and the yield of polysaccharide was selected as response value. The result shown that the regression model fit well with experimental data， and it can well predict the polysaccharide yield of Lentinan. The optimum conditions of ultrasonic extraction were ultrasonic power of 300 W， ultrasonic extraction time of 25 min and solid-to liquid ratio of 1∶30， and the polysaccharide yield was 25.71%. Compared with the theoretical value（25.55%）， it has a smaller relative error at 0.63%. Compared with traditional method， ultrasonic extraction method is more efficient and less time consuming， so it is the ideal extraction method of Lentinan.

hot water extraction；ultrasonic assisted extraction method；polysaccharide yield；response surface optimization；single factor experiment

2014-06-11

万阅，女，硕士，研究方向：天然产物分离纯化及制剂；E-mail：wanyue19890830@126.com

韩静，博士，教授，硕士生导师，研究方向：制药工程技术（纳米、干燥、提取分离）的应用；E-mail：huagonglou314@163.com