脐橙果肉中维生素C 的HPLC 分析研究

李玉明，肖 亮，李 薇，刘 剑

（衡阳师范学院化学与材料科学学院，湖南 衡阳 421008）

脐橙的营养既丰富又全面，含有大量的维生素C 和胡萝卜素，具有很高的营养保健价值。人体不能合成维生素C，维生素C 的生理功能主要有抗坏血病，保证胶原蛋白的正常合成，保护牙龈，预防动脉硬化，抗氧化作用[1]，治疗贫血，防癌，提高人体的免疫力[2]，提高机体的应急能力等[3]。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

LC-10Avp 高效液相色谱仪，UV2501 紫外- 可见分光光度仪，AS3120 超声波脱气装置，AP-01 真空抽滤装置，电子分析天平。

维生素C 标样（含量为99.7%），纯水（自制），甲醇（色谱纯），磷酸（分析纯），脐橙（市售）。

1.2 实验方法

1.2.1 流动相的配制

将纯水用0.45μm 微孔滤膜真空抽滤，装在洁净的大试剂瓶中，然后超声波脱气15 30min，备用。将甲醇用超声波脱气15 30min，备用。

1.2.2 标准溶液的配制

称取50.0mg 维生素C 样品，用纯水溶解，转入容量瓶内，定容至500mL，配制成0.1mg·mL-1的维生素C 标准溶液，再配成浓度分别为0.02mg·mL-1、0.04mg·mL-1、0.06mg·mL-1、0.08mg·mL-1、0.10mg·mL-1的维生素C 标准溶液。

1.2.3 样品溶液的配制

称取一定量的脐橙果肉于研钵中，研磨充分，加适量0.1%的磷酸溶液，超声波提取0.5h 后，过滤，将滤液高速离心5 10min，取上清液，再用纯水稀释定容至250mL，摇匀，经0.45μm 微孔滤膜真空抽滤，脱气，待用[4-5]。

1.2.4 分析方法

配制好流动相、标准溶液和样品溶液，采用标准曲线法确定最佳分析条件，再定量分析[6]。

2 结果与讨论

2.1 测定波长的选择

将维生素C 用紫外光谱仪在波长200 400nm范围内扫描，发现在267nm时色谱图的峰面积最大，波形最好，吸收最高。结合文献资料，本实验选择267nm和254nm为维生素C的HPLC分析检测波长。

2.2 流动相及流速的选择

考虑到维生素C 在酸性环境中相对比较稳定，起初选择pH 值为酸性的流动相，采用甲醇以及0.1%的磷酸以不同的比例混合作为流动相进行实验，结果出现的峰杂乱，峰形不好，保留时间相对较长。然后改用纯水作为流动相进行实验，出峰很好，并采用现配现测的方式来避免维生素C 的不稳定性。

A.检测波长：267nm；流动相：甲醇；流动相流速：0.6mL·min-1；检测温度：25℃；进样：10μL。实验测定结果显示，维生素C 的出峰不理想，有较多杂峰。

图1 A 测定条件下维生素C 的标准溶液浓度和峰面积标准曲线

B.检测波长：267nm；流动相：纯水；流动相流速：0.6mL·min-1；检测温度：25℃；进样：10μL。

C.检测波长：267nm；流动相：纯水；流动相流速：1.0mL·min-1；检测温度：25℃；进样：10μL。

图2 C 测定条件下维生素C 的标准溶液浓度和峰面积标准曲线

D.检测波长：254nm；流动相：纯水；流动相流速：0.8mL·min-1；检测温度：25℃；进样：10μL。

图3 D 测定条件下维生素C 的标准溶液浓度和峰面积标准曲线

E.检测波长：267nm；流动相：纯水；流动相流速：0.8mL·min-1；检测温度：25℃；进样：15μL。

F.检测波长：267nm；流动相：纯水；流动相流速：0.8mL· min-1；检测温度：25℃；进样：10μL。

图4 E 测定条件下维生素C 的标准溶液浓度和峰面积标准曲线

表1 在F 测定条件下不同浓度的维生素C 标准溶液的峰面积以及保留时间

图5 F 测定条件下维生素C 的标准溶液浓度和峰面积标准曲线

由实验过程可知，用甲醇作流动相时液相色谱峰峰形杂乱，纯水作流动相时，峰形相对来说都较好。由图1 到图5 对比得出以下结论：维生素C 标准溶液浓度和峰面积标准曲线的线性方程线性关系好，R2值比较接近且均在0.98 以上，保留时间波动不大。当检测波长为267nm，流动相为纯水，流动相流速0.8mL·min-1，检测温度25℃，进样量为10μL时，HPLC 分析实验结果最好，峰形好，线性相关性最好。所以，脐橙果肉中维生素C 的HPLC 分析检测条件为：以纯水作流动相，检测波长为267nm，流动相速度为0.8mL·min-1，检测温度为25℃，进样量10μL。

2.3 维生素C 标准溶液色谱图

以纯水作流动相，检测温度为25℃，进样量10μL，检测波长为267nm，流动相速度为0.8mL·min-1，维生素C 标准样品溶液色谱图见图6。

图6 维生素C 标准溶液色谱图

2.4 待测样品重复性的测定

样品的重复性实验结果见表2。表2 结果表明，重复性的精密度相对较高，相对标准偏差为0.70%。重复性的精密度越高，偏差越小，说明该实验中的随机误差小。

表2 样品重复性实验结果

3 结论

本文对脐橙果肉中维生素C 的HPLC 分析方法进行了研究，经过一系列的实验条件探索，得出最佳实验条件为：以纯水为流动相，检测波长为267nm，流动相流速为0.8mL·min-1；检测温度25℃。在此条件下得出的液相色谱峰峰形好，峰面积大，标准溶液浓度与峰面积具有良好的线性关系，其相关系数R2＝0.9993，脐橙果肉待测样品重复性实验相对标准偏差为0.70%，表明重复性的精密度高，实验中的随机误差小。该实验方法简单、高效、准确度高，适用于脐橙果肉中维生素C 含量的测定。

[1] 王镜岩.生物化学(上册)[M].北京：高等教育出版社，2007：461-463.

[2] 吴梧桐.生物化学[M].北京：高等教育出版社，2007：54-55.

[3] 朱志伟.坏血病的克星-维生素C[J].大学化学，2010(25)：66-68.

[4] 于世林.高效液相色谱方法及应用[M].北京：化学工业出版社，2000：30-34.

[5] 何优选，梁奇峰.高效液相色谱法测定梅县沙田柚果肉中维生素C 的含量[J].光谱实验 室，2010，27(4)：1290-1293.

[6] 汪正范.色谱定量与定性分析[M].北京：化学工业出版社，2000：60-63.