大孔树脂纯化银杏叶中总黄酮的工艺研究

陈修文曾 峥唐文文陈小明

（1.湖南科技学院 生命科学与化学工程系，湖南 永州 425199；

2.湖南科技学院 湘南优势植物资源综合利用 湖南省重点实验室，湖南 永州 425199；3.桂林医学院 附属医院药学部，广西 桂林 541001）

大孔树脂纯化银杏叶中总黄酮的工艺研究

陈修文1,2曾 峥3唐文文1陈小明1,2

（1.湖南科技学院 生命科学与化学工程系，湖南 永州 425199；

2.湖南科技学院 湘南优势植物资源综合利用 湖南省重点实验室，湖南 永州 425199；3.桂林医学院 附属医院药学部，广西 桂林 541001）

目的 研究不同型号大孔树脂纯化银杏叶总黄酮的工艺条件及参数。方法 以静态饱和吸附量、洗脱量、静态洗脱率考察指标，比较了5种大孔树脂，以总黄酮的含量为指标对树脂吸附工艺条件进行了筛选。结果 所比较的8种大孔吸附树脂中，D101树脂具有最佳的吸附及洗脱参数，在上样液浓度为4.0 mg·mL-1条件下，上样体积为35mL，用70% 的乙醇作为洗脱剂，洗脱流速为3 mL·min-1，得到总黄酮含量为56.89%。结论 D101树脂综合性能较好，可有效地用于银杏叶黄酮的分离富集。

大孔树脂；银杏叶；总黄酮；纯化

近年来，银杏叶的研究开发成为国内外的瞩目热点，它不仅是一种天然药物，其药品及有关产品在国际上十分走俏，而且还是一种优良的功能性食品添加剂[1]。银杏叶中主要有效成分为黄酮类和萜内酯类，其中银杏黄酮具有扩张血管、抑制血小板活化因子、抗氧化、调血脂等作用，可用于治疗心脑血管疾病、肾病综合征、糖尿病、血管性痴呆等[2-4]。中国拥有银杏资源优势，开发潜力很大[5]，而永州作为一个银杏种植基地，一直并未开发。本文针对永州本地银杏叶，采用静态吸附-解吸实验，筛选最佳大孔树脂，对大孔树脂分离纯化银杏叶黄酮的主要影响因素进行考察，优化树脂分离工艺参数，为开发利用银杏叶黄酮提供实验依据。

1　仪器、材料和试剂

1.1仪器

实验仪器：KQ5200B 型超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司)；UV –2800型紫外可见分光光度计(上海舜宇恒平科学仪器有限公司)；HH -4S型水浴锅(天津泰斯特仪器有限公司)；RE52CS 旋转蒸发仪(上海荣生仪器厂)；SHB-循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；粉碎机(江阴市伟翔药化机械厂)；BS110S电子分析天平(北京赛多利斯天平有限公司)。

1.2材料与试剂

银杏叶，采集于湖南永州市东安县，晒干后贮藏。芦丁标准品(中国药品生物制品检定所)；亚硝酸钠、硝酸铝、三氯化铝、三氯化铁、无水乙醇、氢氧化钠、盐酸、浓硫酸均为分析纯；大孔吸附树脂AB-8型、LKY-02型、HPD750型、MD130型、D101型、HPD450型、HPD5000型、MD131型（均为南开大学化工厂）。

2　方法与结果

2.1总黄酮含量测定

2.1.1取粉碎的银杏叶药材适量，加10倍(生药量) 的65% 乙醇回流提取2次，每次3 h，过滤，合并滤液，减压回收至干，备用。

2.1.2 芦丁标准曲线的绘制 准确称取6.2mg芦丁标准品，用70%乙醇溶解并定容至25mL，摇匀，即得芦丁标准品溶液，浓度为0.24mg·mL-1。分别精密吸取芦丁对照品溶液(0.24 mg·mL-1) 0、0.25、0.5、0.75、1.00、1.25、1.50mL至10mL量瓶中，分别加入5%亚硝酸钠溶液0.30 mL，摇匀，静置6min；再加10%硝酸铝溶液0.30mL，摇匀，静置6min，再加4%氢氧化钠溶液4.00mL，用70%乙醇稀释至刻度，摇匀，静置15min。以70%乙醇为空白，在510nm处测吸收度。得标准曲线方程为浓度C和吸收度A的关系：y=0.652x + 0.001，r=0.998。

2.1.3样品测定 准确称取0.50g提取物，用70%乙醇溶解并定容至25mL；精确量取1.0mL，用70%乙醇定容至100mL量瓶中。精确量取5mL，按照制订标准曲线的方法,测定吸收度，计算总黄酮浓度。

2.2不同型号吸附树脂筛选研究

2.2.1树脂的预处理[6]将大孔树脂于95%乙醇中浸泡8h，然后用蒸馏水洗至无乙醇味；再用5%HCl溶液浸泡3h，用蒸馏水洗至流出水pH值为中性；然后用5%NaOH溶液浸泡3h，用蒸馏水洗至流出水pH值为中性。每次上样洗脱完毕后，先用2%HCl洗至无色及用蒸馏水洗至pH值为中性；再用2%NaOH洗至无色,最后用蒸馏水洗至pH值为中性。

2.2.2大孔树脂静态吸附量测定 准确称取已处理好的8种不同型号大孔树脂(用滤纸吸干)1g，置于三角瓶中，加入配制好的浓度为4.0 mg·mL-1的银杏叶黄酮提取液100mL，置于摇床中(25℃，50r/min)静态吸附24h，测其溶液的吸光度，代入回归方程计算相应的黄酮浓度。按下式计算每一种树脂对总黄酮的静态饱和吸附量，吸附率及解吸率，结果见表1。

式中：Q 为静态吸附量( mg /g)；C0为初始浓度(mg·mL-1)；Cv为剩余浓度(mg·mL-1)；V 为溶液体积(mL)；W 为树脂质量( g )。

假设吸附前后溶液体积不变, 按下式计算吸附率：

取上述吸附饱和的大孔吸附树脂用蒸馏水洗至洗脱液无色，滤纸吸干树脂表面残留的溶液，置于三角瓶中，加入80mL 90% 乙醇溶液置于摇床中(25℃，50r /min) 进行静态解吸24h，将树脂滤出，测定滤液中总黄酮浓度，并按下式计算解吸率：

C为解吸液浓度(mg /mL)；V为解吸液体积(mL)；Q为静态吸附量( mg /g)；M为树脂质量(g)。

表1. 八种大孔树脂对银杏黄酮的吸附率及解吸率

结果表明：各树脂的静态饱和吸附量相差较大，其中D101树脂的饱和吸附量及解吸率均明显优于其他各型号树脂，综合考虑吸附和解吸两方面的因素，可以认为D101树脂对银杏叶总黄酮具有较好的吸附解吸能力，因此初步确定选用D101树脂纯化银杏叶总黄酮。

2.3动态吸附实验

2.3.1最大吸附量考察 浓度为4.0mg/mL的银杏叶黄酮提取液100mL通过D101大孔树脂的吸附柱，D101大孔树脂装柱(φ l.5cmx30cm)，径高比为1:8，上样量是100mL上述储备样品液，控制上样流速为2.04mL/min，每次收集5mL过柱液为一管，逐管取ImL检测其黄酮含量。

从图1也可以看到，泄露曲线呈现出一个浓度梯度，本实验在装柱径高比为1:8时，找到最佳泄露点（泄漏点是指该处泄漏液黄酮的浓度值为上柱前样液黄酮浓度值的1/10），宜量取35mL上样液。

图1. D101大孔树脂吸附银杏叶总黄酮的泄露曲线

2.3.2 洗脱剂浓度对银杏叶总黄酮转移率及含量影响 取35mL(总黄酮浓度4.0mg/mL)银杏叶样品液，上柱后用分别用30%、50%、70%、95%的乙醇洗脱。收集洗脱液,将乙醇洗脱液回收乙醇，分别浓缩，真空干燥、称重。测定总黄酮转移率和含量，结果见表2。由表可知乙醇浓度95%时转移率较高，但是由于乙醇浓度高，将大部分杂质洗脱下来，含量很低。30%乙醇洗脱时，转移率和含量都较差。相对于50%乙醇浓度，70%乙醇洗脱黄酮含量高，因此洗脱剂选择乙醇浓度为70%。

表2.不同浓度乙醇洗脱部分总黄酮转移率及含量

2.3.3洗脱液流速对总黄酮转移率影响 准确处理好的D101树脂4份，分别上柱(柱子的径高比为1：8)，准确吸取50mL(总黄酮浓度4.0 mg·mL-1)银杏叶样品液，以流速1mL/min上柱，吸附完全后，洗脱时分别以1、2、3、4 mL·min-1进行洗脱。70%乙醇洗脱液浓缩干燥,测定总黄酮浓度，计算转移率，结果见表3。

表3. 流速对D101树脂转移率的影响

由表可知洗脱流速为3 mL·min-1时转移率相对较大，洗脱流速为2 mL·min-1转移率也较大，但是速度慢，综合考虑选择mL·min-1作为洗脱液流速。

2.4银杏叶总黄酮纯度测定结果

在银杏叶黄酮提取原液中，黄酮纯度为8.51%，经D101树脂在最佳工艺条件下精制后总黄酮纯度为56.89%。说明大孔吸附树脂技术可以用于银杏叶黄酮的分离纯化工艺中。

3　讨　论

在所选择的8种大孔树脂中，根据静态吸附实验，我们初步确定D101型大孔树脂属于快速吸附树脂，吸附量和解吸率都较高，是理想的适用于银杏叶黄酮吸附分离的树脂类型。根据动态吸附试验结果表明：装填己经预处理D101树脂的径高比为1:8，上样液浓度为4.0 mg·mL-1，上样体积为35mL，用70% 的乙醇作为洗脱剂，洗脱流速为mL·min-1，得到总黄酮含量为56.89%。

[1]卢锦花,胡小玲,岳红.吸附树脂提取分离银杏叶提取物的研究进展[J].化工进展,2001,3:1-4.

[2]廖森,叶任高.银杏黄酮甙与抵克立得治疗原发性肾病综合征高凝状态的临床研究[J].中国中西医结合肾病杂志,2000,1(3): 159-166.

[3]齐岩,王智勇,谢敬东.银杏叶的药理作用研究进展[J].沈阳医学,2003,23(2):68-69.

[4]张荣怀,李源,王晓明,等.银杏黄酮甙对人巨细胞病毒感染促进动脉粥样硬化发生和发展的保护作用[J].中国临床康复,2004, 8(9):1714-1716.

[5]王德伟,朱红,高尔.银杏黄酮的药理作用和临床应用[J].食品与药品,2006,8(6):7-9.

[6]张素华,王正云.大孔树脂纯化芦笋黄酮工艺的研究[J].食品科学,2006,27(2):182.

（责任编校：何俊华）

Q94

A

1673-2219（2015）05-0058-03

2014－12－21

湖南科技学院湘南优势植物资源综合利用湖南省重点实验室开放基金(项目编号：XNZW14C04); 湖南科技学院校级课题资助(项目编号14XKY108)。

陈修文（1987－），男，湖南永州人，硕士，研究方向为天然药物研究。