豁痰解毒通络饮对AngII诱导大鼠心肌细胞增殖IL-1β、TNF-α mRNA的影响

沈娟娟，邓　悦，张兆志（长春中医药大学附属医院，吉林 长春 130117）

豁痰解毒通络饮对AngII诱导大鼠心肌细胞增殖IL-1β、TNF-α mRNA的影响

沈娟娟，邓悦，张兆志
（长春中医药大学附属医院，吉林 长春 130117）

目的研究豁痰解毒通络饮对大鼠心肌细胞增殖及IL-1β、TNF-α mRNA的影响。方法 采用血清药理学方法，体外培养大鼠心肌细胞系，分为正常组、模型组、豁痰解毒通络方组、缬沙坦组、吡格列酮组。MTT法检测大鼠心肌细胞增殖情况。RT-PCR法检测白介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）mRNA的表达。结果 血管紧张素II（Ang II）作用细胞12 h后，与空白组比较，IL-1β、TNF-α mRNA表达极显著增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。与模型组比较，豁痰解毒通络饮干预后，IL-1β、TNF-α mRNA表达极显著下调（P＜0.05）。结论 豁痰解毒通络饮能够抑制Ang II诱导大鼠心肌细胞增殖，下调IL-1β、TNF-α mRNA的表达。

豁痰解毒通络饮；心肌重构；心肌细胞肥大；大鼠

近年来左心室肌肥厚与炎症机制的关系备受关注。炎症因子在体内释放后相互作用，通过免疫调控网络参与左心室肌肥厚的发生和发展过程［1］。炎症应答是高血压病靶器官损伤的重要致病因素［2］。运用中医学组方治疗心肌肥厚的报道较少。本论文将AngII诱导大鼠心肌细胞增殖所致炎症状态与中医“痰、瘀、毒”理论结合起来，用豁痰解毒通络饮含药血清对Ang II诱导大鼠心肌细胞增殖及IL-1β、TNF-α mRNA的表达影响，探讨其作用的可能性机制，为临床的应用治疗提供客观理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级W istar雄性大鼠50只，30日龄，体质量（280±20）g，动物合格证号：SCXK（吉（2003-0001，由吉林大学医学院动物实验中心提供。大鼠普通饲料。大鼠心肌细胞系H9c2（2-1）（购自上海中科院）。

1.2 药品与试剂

中药：豁痰解毒通络饮：甘松、丹参、当归等药物组成。生药由长春中医药大学附属医院制剂中心提供，由中药房代煎浓缩而成，含生药量为2.33 g/m l，4℃冰箱保存。

Ang II（Sigma公司，MA 02139-1517）、缬沙坦（北京诺华制药有限公司，批号H 20040217，规格80 m g）、DM EM培养基（Hy c lone公司，SH 30022.01B）、胰蛋白酶（H y c lone公司，SV 30031.01）、胎牛血清（H y c lone公司，SV 30087.02），RT-PCR试剂盒（TaKaRa公司，e98237），PCR引物由上海生工有限公司合成。

1.3 实验仪器

电泳仪（北京六一仪器厂，DYY-2D）；基因扩增仪（Ferrotec公司，TC-96/G/H（b（A）；离心机（凯特实验仪器有限公司，TG12M）；AIR TECH净化工作台（苏净集团安泰公司，HWDCB-1340）。

1.4 实验方法

1.4.1 含药血清制备

50只W istar大鼠适宜性喂养一周后，将其随机分为5组，依次为空白组、模型组、豁痰解毒通络组、缬沙坦组、吡格列酮组。空白组和模型组灌胃等体积蒸馏水。豁痰解毒通络组的灌胃剂量为16.3 mg/kg，缬沙坦组灌胃剂量为30 mg/kg，吡格列酮组灌胃剂量为50 mg/kg，相当于人临床用量7倍。动物给药体积为10 m l/kg。连续用药7天，1次/d，于末次给药后2 h，腹主动脉取血分离血清［3］。56℃水浴灭活30 m in，微孔滤膜灭活滤菌，-80℃冷藏备用。

1.4.2 心肌细胞培养及分组给药

H 9c2细胞培养于含10%小牛血清的高糖DM EM培养基中，经0.25%胰蛋白酶消化分离，于平皿培养板中传代接种。随机分为5组，分别为空白组（不加药物和AngⅡ刺激）、模型组（AngⅡ 10～7 mol/L刺激）、豁痰解毒通络组、缬沙坦组、吡格列酮组（不同组别含药血清预先培养2 h后，AngⅡ 10～7 mol/L刺激12 h）［4］。

1.4.3 含药血清的毒理学评价

应用M TT比色法进行分析。96孔培养板培养H9c2细胞，细胞浓度为4×105个，37℃，5%CO2条件下培养18 h后，每孔加入不同质量浓度的含药血清培养2 h，加Ang II 10-7mol/L刺激细胞18 h，后每孔加入MTT溶液（5 mg/m L）20 μL，37℃培养4 h后弃上清液，每孔加入二甲基亚砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）150 μL，振荡10 m in，选择490 nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值（OD值）。

1.4.4 RT-PCR测定原癌基因IL-1β、TNF-α mRNA的表达

提取细胞总RNA。采用RNA试剂盒提取总RNA，将RNA加入Rnase ddH 2O中。根据紫外分光光度计测定RNA浓度和纯度。重复3次，计算样品总RNA浓度OD260：OD 280比值在1.8～2.0。逆转录聚合酶链式反应：按照反转录聚合酶链式反应（reverse transcription Polym erase Chain Reaction，RT-PCR）试剂盒（TAKARA）的说明。进行目的基因扩增。TNF-α引物（Forward Primer：5'-GGTCCCAACAAGGAGGAGA-3'，Reverse Primer：5'-TGGTATGAAATGGCAAATCG-3'，特异性扩增片段为329bp）；IL-1β引物（Forw ard Primer：5'-CTCATTGTGGCTGTGGAGAA-3'，Reverse Primer：5'-GGGATTTTGTCGTTGCTTGT-3'，特异性扩增片段为323bp）；β-actin引物（Forw ard Prim er：5'-GCCGTCTTCCCCTCCATCGTG-3'，Reverse Primer：5'-TAC GACCAGAGGCATACAGGGACAAC-3'，特异性扩增片段为357bp）。PCR条件为：94℃预变性5 m in；94℃变性30 s；72℃延伸45 s；72℃最后延伸7 m in；共30个循环。TNF-α、IL-1β、β-actin m RNA退火温度依次为54.8℃、58.2℃、60℃。PCR产物的检测和分析：PCR产物5 μL，2%琼脂糖凝胶电泳30 min（80 V），以β-actin PCR反应产物为内参，进行电泳检测，用AlphaImager EP凝胶成像仪分析系统进行拍照和灰度分析。mRNA相对表达水平以积分光度比值：（目的基因条带强度×面积）/（参照基因条带强度×面积）表示。

1.5 统计学方法

采用SPSS 13.0软件统计学软件对数据进行处理，数据以“±s”表示，采用ONEWAY-ANVONA方法分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 含药血清的毒理学评价

豁痰解毒通络饮、缬沙坦、吡格列酮组含药血清组15%浓度作用细胞后，较模型组及空白组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。说明豁痰解毒通络饮有抑制大鼠心肌细胞H9c2增殖的作用，其抑制作用以10%倍剂量最佳。见图1。

2.2 含药血清对AngII诱导心肌细胞IL-1β、TNF-αmRNA的影响

图1 MTT检测结果

模型组较空白组比较，IL-1β、TNF-α mRNA的表达极显著增强（P＜0.05），豁痰解毒通络组、缬沙坦组及吡格列酮组较模型组比较，IL-1β、TNF-α mRNA表达极显著下调（P＜0.05）。见图2。

图2 RT-PCR检测IL-1β、TNF-α mRNA的表达

3 讨 论

高血压病的主要靶器官损害见于左心室肥厚，左心室肥厚是心血管疾病主要危险因素，是现代心血管疾病中亟待解决的问题［5］。肿瘤坏死因子TNF-α、IL-1β既是其活化信号通路的上游因素，又是活化信号通路的产物，两者即相互作用，在高血压病左室肥厚病程演变过程中发挥主要的作用［6］。

本研究通过观察豁痰解毒通络饮抑制AngⅡ诱导H9c2细胞增殖的影响，发现豁痰解毒通络饮能够极显著降低IL-1β、TNF-α mRNA的表达。说明豁痰解毒通络饮具有抑制大鼠心肌细胞增殖的作用，并能下调IL-1β、TNF-α mRNA的表达。为临床的应用治疗提供客观理论依据。

［1］ 张群豪.用药物血清学方法观察血俯逐瘀浓缩丸对实验性动脉粥样硬化家兔主动脉平滑肌细胞增殖的影响.中国中西医结合杂志，2006，16（3）:156.

［2］ 邱幸生.益气通络方对缺氧再给氧心肌细胞bc l-2基因表达影响的血清药理学研究.中国中医基础医学杂志，2011，7（3）:38-40.

［3］ 米永杰，李 健.中药血清药理学研究概述.四川解剖学杂志，2006，14（4）:35

［4］ 吴健宇，李仪奎，符胜光.补阳还五汤保护自由基损伤血管内皮细胞的血清药理实验方法的建立.中药药理与临床，2009，15（1）:45

［5］ 韩学杰，丁 毅，王丽颖，等.高血压病痰瘀互结与炎症因子相关的机制探讨［J］.中华中医药杂志，2010，5:362.

［6］ Cai D，Frantz JD，Tawa NE Jr，et al.IKKβ/NF-κB activation causes severe muscle wasting in mice，Cell，2004，119:285.

本文编辑：吴玲丽

The effect of huo tan jie du tong luo drink on the expression of AngII-induced cardiom yocyte proliferation in rats IL-1β，TNF-α m RNA

SHEN Juan-juan，DENG Yue，ZHANG Zhao-zhi
（The A ffiliated Hospital of Changchun University of Chinese Medicine，Jilin Changchun 130117，China）

Ob jective To study the effect of the huo tan jie du tong luo drink on cardiac m yocyte proliferation and the expression of IL-1β、TNF-α mRNA.M ethods Serum pharmacology，cultured rat myocardial cells， divided into normal control group，model group，huo tan jie du tong luo drink group，valsartan group，pioglitazone group.And myocardial cell proliferation was measured by MTT assay.The expression of IL-1β，TNF-α mRNA was measured by RT-PCR assay.Results AngII infected cells for 12h， compared w ith the normal group，the expression of IL-1β，TNF-α mRNA was significantly increased（P＜0.05）.Compared w ith the model group，huo tan jie du tong luo drink intervention，the expression of IL-1β，TNF-α mRNA decrease（P＜0.05）. Conclusion Huo tan jie du tong luo drink induced angII-induced cardiomyocyte proliferation in rats and decrease the expression of IL-1β，TNF-α mRNA.

Huotanjiedutongluo drink；Myocardial remodeling；Cardiac myocyte hypertrophy；Rats

R289.5

B

ISSN.2095-6681.2015.27.183.03

吉林省卫生厅科研课题（课题编号20132040）