农药多抗性哈茨木霉的常压室温等离子体诱变

周文臣詹晓北，朱莉郑志永吴剑荣

（1.江南大学生物工程学院　糖化学与生物技术教育部重点实验室，无锡　214122；2.江苏瑞光生物科技有限公司，无锡　214125）

农药多抗性哈茨木霉的常压室温等离子体诱变

周文臣1詹晓北1，2朱莉2郑志永1吴剑荣1

（1.江南大学生物工程学院糖化学与生物技术教育部重点实验室，无锡214122；2.江苏瑞光生物科技有限公司，无锡214125）

旨在为提高生防木霉菌对田间除草剂、杀虫剂以及杀菌剂共存的复杂环境的适应性，以生防菌哈茨木霉（Trichoderma harzianum，GIM 3.442）为出发菌株，采用常压室温等离子体的方法对出发菌株进行诱变。结果显示，以杀菌剂代森锰锌和杀虫剂呋虫胺为筛子，选育出对复合农药有良好抗性的诱变菌株。从中挑选双抗性最好的菌株Th-36，以含有杀菌剂代森锰锌、杀虫剂呋虫胺和除草剂乙氧氟草醚的PDA为诱变筛选培养基，再次进行诱变筛选，获得两株具有三抗特性菌株（Th-3-36和Th-4-B）。毒力测试表明，抗性菌株Th-3-36和Th-4-B对代森锰锌、呋虫胺和乙氧氟草醚的EC50分别达到5 089.2 μg a.i.·mL-1和5 498.2 μg a.i.·mL-1、758.5 μg a.i.·mL-1和785.9 μg a.i.·mL-1、198.2 μg a.i.·mL-1和200.3 μg a.i.·mL-1，均高于各农药的市售平均推荐使用浓度。筛选到的突变株对农药抗性明显增强、遗传了亲本的广谱抗菌性并具有良好的遗传稳定性，生长繁殖能力和酶学性质优于亲本菌株。

常压室温等离子体诱变（ARTP）；哈茨木霉；农药抗性；驯化选育

传统化学农药由于操作简单、见效迅速、能快速大规模生产而在农业生产中广泛使用，但其泛滥使用会导致“3R”（抗性Resistance、残留Residue、再猖獗Resurgence）问题和生态环境恶化［1，2］。生物防治（biological control）是利用天然产物，生物体如细菌、真菌、线虫、昆虫或其代谢产物等对植物病害进行有效防治的技术与方法［3］，而生防制剂（biological control agents，BCAs），即生物杀菌剂是利用天然产物、微生物活体及其代谢产物所生产的、对植物病害起防治作用的制剂。它不仅可以减少传统农药对环境的危害、在动植物体中的残留，还可以避免病菌对农药产生抗性而导致的农药失效［4］。典型的生防菌，如木霉菌（Thchoderma spp.），由于其生存范围广泛、拮抗病原菌广谱（至少对18个属，29种病原真菌具有拮抗性）［5，6］，对温度、pH、氧浓度和紫外照射等不利环境条件耐受性强［7］，防病机制多样，低毒且对环境友好，已经应用于许多大田作物和园艺作物的土传真菌病害的防治［8］。目前全球已经约有50多种木霉制剂在售［9］。根据最新报道，许多生防木霉菌还能起到改善土壤环境［10］，降解残留农药的作用［11］。

哈茨木霉是目前使用最多的生防木霉菌，可以用于防治如丝核菌、疫霉菌、腐霉菌等植物病原真菌［12］。早在1981年，哈茨木霉防治李属果栩银叶病（Chondrostereum purpureum）的木霉生防制剂已经在西欧商品化生产［13］，近年来，以色列、美国拜耳公司也推出哈茨木霉生防制剂产品［14］。但是，在实际农业生产过程中，植物病原菌、杂草、虫害等有害生物共存于农田生态环境之中，某些杀虫剂、除草剂以及其他化学杀菌剂的使用和残留会对生防木霉的生长、产孢量产生不良的影响，也导致木霉生防作用下降，限制了其田间单独使用的效果和范围。因此，生防木霉菌与农药的关系［15］，通过诱变育种、原生质体融合、遗传改造等手段改良野生生防菌的特性［16-18］、提高其耐药性和与其他杀菌剂的混用［19-22］，已经引起人们的兴趣与重视。但是，目前的研究多集中在生防菌对杀菌剂的抗性提高，有关木霉菌对除草剂和杀虫剂的抗性提高的报道很少，还未有对除草剂和杀虫剂抗性菌株的选育的报道。由清华大学开发的常压室温等离子体诱变系统（ARTP）能够在大气压下产生温度在25-40℃之间、具有高活性粒子（包括处于激发态的氦原子、氧原子、氮原子、OH自由基等）浓度的等离子体射流，改变细胞膜或者细胞壁通透性、DNA和蛋白质等大分子结构，造成基因损伤从而引起微生物发生突变［23］。近年来，该项突变技术已经被成功应用于突变细菌、微藻、酵母等微生物［24-26］。生防木霉菌对农药的敏感性与细胞骨架的重要组成成分微管有关，微管的主要成分为微管蛋白，微管蛋白和农药的亲和力下降，造成真菌耐药［27］。ARTP对蛋白质等大分子的结构影响以及前人应用该项技术突变微生物的成功案例使得ARTP在改造生防菌耐药性能方面潜力巨大，但目前为止还未见到有应用此项技术改良生防木霉菌性能的报道。本研究以哈茨木霉（Trichoderma harzianum GIM 3.44）为出发菌株，采用常压室温等离子体诱变（ARTP）和含复合农药培养基相结合的方法筛选对农药有交叉抗性的生防木霉菌，挑选出两株对杀虫剂呋虫胺、除草剂乙氧氟草醚和杀菌剂代森锰锌具有综合抗性的抗药性菌株，并检测其各项生理指标，旨在为提高生防木霉菌对田间除草剂、杀虫剂及杀菌剂共存的复杂环境适应性提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种 哈茨木霉（Trichoderma harzianum Rifai）GIM 3.442，购于中国广东省微生物菌种保藏中心。棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. Sp）ACCC 36882、棉花黄萎病菌（Verticillium dahliae Kleb）ACCC 36211、核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）ACCC 36908，购于中国农业科学院植物保护研究所。马铃薯早疫病菌（Alternaria solani），由江南大学生化工程与生物反应器实验室活化并保藏。

1.1.2 培养基 保藏和孢子制备：马铃薯综合培养基（PDA）（g/L）：马铃薯汁200，葡萄糖20，KH2PO43，MgSO4·7H2O 1.5，硫胺素0.008，琼脂20，pH6.0，于121℃灭菌20 min。

含药PDA培养基的制备：先把农药用无菌水配制成母液，再用灭菌水稀释成一定倍数，添加到40-50℃的综合PDA培养基中。

液体培养基（g/L）：葡萄糖 20，酵母浸粉 15，（NH4）2SO42.5，KH2PO46.0，MgSO4·7H2O 0.8，pH6.0，25℃。

1.1.3 试剂 除草剂：果儿（乙氧氟草醚23.5%乳油），上海惠光有限公司；锄当家（30%草甘膦水型），深圳诺普信农化有限公司；盖能草（高效氟吡甲禾灵，108 g/L乳油），美国陶氏益农。

杀菌剂：75%百菌清可湿性粉剂，利民化工股份有限公司；80%代森锰锌可湿性粉剂，印度联合磷化有限公司；99%噁霉灵可湿性粉剂，山东天达股份有限公司。

杀虫剂：20%呋虫胺可湿性粉剂，日本三井化学AGRO株式会社；快绝特（0.3%苦参碱水型），南通新华农药有限公司。

N-乙酰-氨基葡萄糖和海带多糖购于Sigma公司，其余试剂均为国药生产。

1.1.4 诱变系统 ARTP（常压室温等离子体）诱变育种仪，江南大学生物工程学院购于清华大学无锡应用技术研究院生物育种研究中心，产品型号：ARTP-Ⅱ。

1.2 方法

1.2.1 ARTP诱变哈茨木霉 将保存在斜面的哈茨木霉菌株经过液体培养基25℃，110 r/min震荡培养活化后涂布到PDA培养基上，25℃恒温培养5-7 d至孢子成熟。用30 mL左右的无菌生理盐水冲洗孢子，冲洗液经灭菌纱布（4层）过滤除去菌丝体，用无菌生理盐水稀释成OD500的值在0.54-0.88（孢子浓度在108cfu/mL）之间的孢子悬浮液。诱变方法参照邱雯雯等［24］的诱变处理，稍加改动，分别取20 μL孢子悬浮液至7个载片涂抹均匀，载片置于灭菌平板内，分别经ARTP诱变系统（室温常压，氦气流量为10 SLM，功率为100 W）处理0、30、60、100、140、180和220 s。处理后的载片经灭菌生理盐水冲洗稀释至合适倍数后涂布到含有代森锰锌16 μg a.i.·mL-1，呋虫胺4.5 μg a.i.·mL-1的复合诱变培养基上，25℃恒温培养5-6 d后菌落计数，计算致死率，选取致死率95%以上的诱变剂量为处理剂量。在选定诱变剂量下，将处理后的孢子悬浮液分别稀释的合适倍数后涂布到含有两种目标农药的梯度复合含药培养基上，25℃恒温培养箱内黑暗培养5-6 d后将形成的菌落边缘用8 mm打孔器切取菌饼转接到复合含药PDA上，25℃恒温培养，生长势法挑选生长较快的菌株，转接到PDA斜面上保存待分析。挑选双抗菌株后，按照双抗菌株的筛选方法筛选对3种农药（呋虫胺、代森锰锌、乙氧氟草醚）抗性均提高显著的目标菌株。

1.2.2 农药对突变株室内毒力的测定 采用含毒介质培养法［28］，梯度稀释。

用无菌打孔器从培养3 d的哈茨木霉突变株和原始菌株菌落边缘截取直径8 mm的菌块，将其移植到含不同浓度的代森锰锌（300、1 000、2 000、3 000和5 000 μg a.i.·mL-1）、呋虫胺（165、500、1 000、1 650和1 900 μg a.i.·mL-1）、乙氧氟草醚（60、120、240、480和700 μg a.i.·mL-1）的PDA平板中央，每个培养皿接1个菌饼，每个浓度3次重复，设空白平板为对照，置于25℃恒温培养箱培养。

农药对突变株菌丝生长速率的室内毒力测定：供试菌株在上述条件下培养2 d，用十字交叉法测量菌落直径。并按式（1）计算其生长抑制率。

式中：I为抑制率，R0为对照菌落直径，R为处理菌落直径。

将各抑制率换算成抑制率概率值，以各处理中农药浓度对数值作为自变量x值，以相应处理对菌丝的抑制率概率值为依变量y值，用线性回归法求出供试杀菌剂的毒力曲线方程y=a+bx，计算EC50（抑制中浓度）。

农药对突变株产孢子能力的室内毒力测定：供试菌株在上述条件下培养6 d，用30 mL无菌生理盐水冲洗，玻璃珠打散，光电比浊法测定各农药梯度下的产孢子能力，按照测定农药对菌株菌丝生长EC50的方法测定各农药对菌株产孢子能力的EC50。

农药对突变株孢子萌发的室内毒力测定［29］：将供试菌株和亲本菌株将在PDA生长5-6 d用30 mL灭菌生理盐水冲洗打散，经灭菌纱布过滤除去菌丝体，稀释到合适倍数吸取200 μL，以6×106cfu/mL的接种量接种到含有1.3 mL的含有梯度农药的液体PDA的24 孔培养板中。混匀后用酶标仪测定初始OD500，25℃恒温培养箱培养培养12 h后酶标仪测定OD500，用空白PDA作对照，按照公式（2）计算孢子萌发抑制率，并按照上述方法计算各农药对供试菌株的EC50。

式中：I为孢子萌发抑制率，OD1为对照0 h的OD500，OD2为处理0 h的OD500，OD0为对照12 h的OD500，ODC为处理12 h的OD500。

1.2.3 突变株生长繁殖能力

1.2.3.1 菌丝平均生长速率 将抗性突变体菌株和亲本菌株在 25℃下培养 3-4 d，用直径8 mm的打孔器沿菌落边缘截取菌块接种于PDA培养基上，在25℃恒温黑暗条件下培养，每6 d测定菌落直径。选取12 h的直径D1和36 h的直径D2，按照式（3）计算菌丝平均生长速率，每处理3次重复。

式中：v为菌丝平均生长速率（mm/h），D1为12 h菌落直径，D2为36 h菌落直径。

1.2.3.2 产孢子能力 采用光电比浊法。

1.2.3.3 标准曲线绘制 将在PDA生长5-6 d的哈茨木霉用30 mL灭菌生理盐水冲洗打散，经灭菌纱布过滤除去菌丝体，稀释10、20、30、40、50和60倍，血球计数板准确计数孢子个数，用分光光度计测定各个梯度的OD500值。以OD500为横坐标，孢子浓度为纵坐标制作标准曲线。

哈茨木霉和突变株在PDA平板上生长6 d后，按上述方法，测定产孢子能力。

1.2.3.4 分生孢子萌发率 将各突变株和原始菌株培养5-6 d后用30 mL液体PDA冲洗打散，稀释到107cfu/mL，各吸取50 μL，滴加于凹玻片上，25℃保湿培养，每隔一段时间显微镜下镜检，计算孢子萌发率。

1.2.3.5 种子生长曲线测定 刮取PDA培养基上的孢子接入到装有无菌水的150 mL三角瓶（带无菌玻璃珠）中，25℃，摇床振荡培养2 h，使其混合均匀。

吸取5 mL孢子悬浮液接种到装有50 mL液体培养基的250 mL三角瓶中培养（接种量10%），25℃，往复式摇床110 r/min培养。每隔6 h取5 mL发酵液，8 000 r/min，离心10 min，倒掉上清液取沉淀，水洗涤2-3次，105℃烘箱烘干至恒重。以摇床培养时间（h）为横坐标、菌体干重（g/L）为纵坐标绘制种子生长曲线。

1.2.4 突变株酶学性质 反应体系总体积600 μL包括：200 μL底物，200 μL pH6.0、0.025 mol/L磷酸钠缓冲液，200 μL粗酶液（pH6.0，50℃），恒温水浴反应2 h。反应结束后，沸水浴10 min终止反应。

几丁质酶酶活力定义：在上述反应条件下，每分钟水解生成1 μg N-乙酰-氨基葡萄糖为一个酶活力单位U。

β-1，3葡聚糖酶酶活力定义：在上述反应条件下，每分钟水解生成1 μg葡萄糖为一个酶活力单位U。

1.2.5 突变株拮抗性 采用对峙培养法，将亲本木霉菌株和耐药性木霉菌株分别与核盘菌、马铃薯早疫病菌、棉花枯萎病菌和棉花黄萎病菌，对峙接种在PDA平板上，两接菌点相距30 mm，菌块直径8 mm。同时单独接种作对照。每处理重复3次，在25℃恒温培养。逐日观察各菌落的生长和木霉菌对灰霉菌的抑制作用情况，连续观察6 d，记录R1和R2数据并拍照计算木霉菌平板覆盖率。按照式（4）计算各木霉菌株对病原菌的抑制率。

式中：I为木霉的抑制率，R1为对照病菌落直径，R2为病菌菌落中心到木霉菌落边缘的距离。

木霉覆盖植物病原菌的分级标准为：I：木霉菌丝占据培养皿100%；Ⅱ：木霉菌丝占据培养皿＞2/3；Ⅲ：木霉菌丝占据培养皿1/3-2/3；IV：木霉菌丝占据培养皿＜1/3；V：病原菌菌丝占据培养皿100%。

1.2.6 突变株遗传稳定性 突变型木霉菌株接种在PDA平板上，在25℃恒温培养箱中培养。每5 d转接1次，连续转接10次。观察这些菌株每次转接后的生长特性，测定突变株对抗性农药的EC50，每处理重复3次。将其与亲本相比较。

1.2.7 突变株对其他农药的抗性 配制分别含有300 μg a.i.·mL-1的快绝特、百菌清、盖能草和草甘膦配的含药PDA，切取培养2-3 d的供试菌株8 mm菌块转接到含药PDA中，25℃恒温培养2 d，按照（1）式计算各农药对各突变株的菌丝生长抑制率。

1.2.8 数据统计分析 用SPSS Statistics软件和Duncan’s新复极差法比较Th和各突变株以及各突变株之间在各指标上的显著性差异（P=0.05）。用Image Optimizer软件分析木霉菌拮抗各病原真菌的平板覆盖率，用EXCEL计算毒力回归方程和EC［30］。

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2 结果

2.1 哈茨木霉的ARTP诱变及复合农药抗性菌株筛选通过ARTP诱变和药剂反复驯化，选取致死率在95%以上的100 s为诱变剂量，以T. harzianum为出发株，以农药对菌株的菌丝生长EC50为目标，从200株疑似株中挑选得到5株双抗菌株（Th-17、Th-36、Th-37、Th-41和Th-60，对代森锰锌和呋虫胺有抗性），结果如图1所示。其中，Th-36号菌株的代森锰锌和呋虫胺EC50分别比出发菌株提高6.95倍和4.40倍。以双抗菌株Th-36为诱变突发株，选取致死率为90%以上的90 s为处理剂量，在梯度综合含药平板上筛选，从180株疑似菌株中挑选得到两株三抗（Th-3-36和Th-4-B，对代森锰锌、呋虫胺和乙氧氟草醚有综合抗性）菌株，结果如图2所示。代森锰锌对三抗菌株Th-3-36和Th-4-B的菌丝生长EC50相比Th-36略有提高，分别达到5 089.2 μg a.i.·mL-1和5 498.2 μg a.i.·mL-1，是市售平均推荐使用浓度的5倍左右。相比Th-36，呋虫胺对两株三抗突变株的菌丝生长EC50的变化不大。经过诱变后，突变株对乙氧氟草醚抗性明显提高，乙氧氟草醚对Th-3-36和Th-4-B菌丝生长EC50分别达到198.2 μg a.i.·mL-1和200.3 μg a.i.·mL-1，达到市售使用浓度（表1）。

图1 双抗性菌株筛选结果

2.2 抗药性菌株遗传稳定性

将传代前和传代后菌株进行室内毒力测定，结果如表1、表2所示。相比亲本菌株，杀菌剂代森锰锌、除草剂乙氧氟草醚和杀虫剂呋虫胺对突变株的菌丝生长EC50、孢子产量EC50和孢子萌发 EC50都比出发菌株有显著提高，并且没有随传代次数发生太大的改变，性状遗传稳定。

图2 供试菌株的菌丝生长对抗性药物的敏感性

2.3 突变株和出发菌株生长特性比较

将突变株和亲本菌株在PDA平板上培养，比较其菌丝生长和产孢能力，结果如表3所示。抗性突变株的菌丝生长速率相对Th略有提高，变化较小。Th-3-36、Th-4-B和Th-36产孢子能力分别比出发菌株提高45%、39%和33%左右。在液体PDA培养基上培养6 h后，三抗性突变株的萌发率高于出发菌株，均在20%左右，Th为15%，但在培养12 h和24 h后突变株和出发株无显著性差异。

表1 突变株的菌丝抑制EC50遗传稳定性

表2 突变株和出发菌株产孢子量和孢子萌发EC50

表3 突变株和亲本菌株Th生长特性比较

对比突变株和亲本菌株的种子液生长曲线（图3），突变株进入稳定期相对亲本菌株明显缩短（突变株为24 h，Th为48 h），保持稳定期的时间明显延长（突变株为36 h以上，Th为24 h）。此外，突变株最大生物量也高于出发菌株，三抗菌株可以达到16 g/L，双抗菌株可以达到15 g/L以上，而亲本菌株只有不到12 g/L。突变株更为旺盛的生命力可能与其更强的抗药性之间存在某种关系。

图3 突变株和Th生长曲线比较

2.4 突变株和Th的酶学性质比较

几丁质酶和β-1，3葡聚糖酶能够降解病原真菌的细胞壁的主要成分几丁质和β-1，3葡聚糖，在生防菌拮抗病原真菌中作用重大。对突变株和出发菌株进行上述两种酶产酶能力测定，结果如表4所示。突变株和Th均在培养60 h后开始产酶，但抗性突变株的β-1，3葡聚糖酶最大酶活力比亲本菌株有所提高，Th-3-36是亲本菌株的1.87倍左右，Th-4-B和Th-36菌株是Th的1.71倍左右。抗性突变株产几丁质酶的能力和发酵液总蛋白含量相对出发株稍有提高，但相差较小。

表4 突变株和亲本菌株（Th）发酵产几丁质酶和β-1，3葡聚糖酶总结

2.5 非抗性农药对突变株和Th的菌丝生长抑制率比较

通常农业生产中会使用各种不同的农药，因此选择了其他5种农作物种植中常用农药，测试突变株对其耐受性。在剂量为300 μg a.i.·mL-1条件下测定菌丝生长抑制率，结果如表5所示。其中，突变株对噁霉灵的敏感性降低最大：三抗菌株Th-3-36和Th-4-B分别比亲本菌株降低74.76%和96.35%左右，双抗菌株比亲本菌株降低88.93%左右，而且噁霉灵对Th-4-B的菌丝生长抑制率仅为1.03%。突变株对草甘膦、盖能草的敏感性比亲本菌株降低程度没有噁霉灵显著，平均只比亲本菌株降低19%（Th-36除外）和30%左右。两株三抗突变株对草甘膦、百菌清和快绝特的敏感性和亲本菌株差异较小，且这3种农药对木霉菌株抑制作用较大，300 μg a.i.·mL-1的浓度对木霉的抑制率就可以达到80%以上。

表5 非抗性农药对突变株和亲本菌株（Th）的菌丝生长抑制率（%）

2.6 突变株的拮抗作用为了进一步验证所获得的多抗性木霉菌株的生防抗菌能力，将病菌和木霉菌株进行对峙培养。对峙培养过程中，木霉菌株和植物病菌先分居平板两侧各自生长，2 d左右，棉花黄萎病菌基本停止生长，并在与木霉菌的接触处出现抑菌带，之后菌落逐渐萎缩消亡。棉花枯萎病菌、核盘菌和土豆早疫病菌在对峙培养3 d左右后，菌落停止生长，之后逐渐萎缩。木霉菌迅速占领生长空间，对病原真菌起到竞争性抑制作用。对峙培养6 d后，平板上生长空间大部分被绿色木霉菌覆盖，以Th-4-B突变株和棉花枯萎病菌的对峙效果为例，如图4-A所示。4种病菌的菌丝生长抑制率结果（图4-B）显示，原始菌株和突变株对土豆早疫病菌和棉花黄萎病菌的抑制率达到90%以上，抗病等级为I级；对棉花枯萎病菌和核盘菌的抑制率达到70%以上，抗病等级为Ⅱ。突变菌稳定遗传原始菌株对植物病菌的拮抗性并对植物病原菌表现出良好的拮抗能力。

图4 木霉菌对植物病菌的拮抗能力

3 讨论

木霉菌作为生防因子作用于植物病虫害，相比化学农药具有显著的优势，并已经被许多学者在中药［31］、小麦［32］等田间防治病害试验中证明。但在国内传统作物栽培中，杀虫剂、杀菌剂和除草剂等化学农药的常年大量使用使得木霉菌在实际使用和商业化中受到限制。不同种类的杀菌剂对不同的生防木霉具有不同的抑制作用，从19世纪末20年代初起，常用农药对木霉的抑制作用已经引起学者的兴趣［33］；杀虫剂和土壤处理除草剂对生防木霉也有不同程度的影响，但近几年才有少数相关报道［34］，并且并未见到采用诱变措施提高木霉对除草剂、杀虫剂的耐药性，降低其敏感性的报道。

与前人诱变筛选提高木霉耐药性相比，本研究首次尝试采用常压室温等离子体诱变的方法提高木霉耐除草剂、杀虫剂和杀菌剂的综合能力。以含有杀虫剂（呋虫胺）、杀菌剂（代森锰锌）和除草剂（乙氧氟草醚）的复合含药培养基为筛子，成功筛选出对上述3种农药有高度耐受性的突变型木霉菌株Th-3-36和Th-4-B。杀菌剂和木霉生防菌联用可以降低杀菌剂的使用浓度，并提高木霉菌的防效。牛胜芳等［19］发现啶酰菌胺和哈茨木霉联用可以防治番茄灰霉病菌且协同效果良好；Nallathambi等［35］将木霉菌T.v-CIAH240和多种杀菌剂联用以防治果腐病，可降低化学农药的使用浓度，其中代森锰锌的使用浓度降低到100 μg/g。本实验中代森锰锌对突变株Th-3-36和Th-4-B的菌丝生长EC50分别达到5 089.2 μg a.i.·mL-1和5 498.2 μg a.i.·mL-1，是市售平均推荐使用浓度的5倍左右，是尹婷等［16］诱变得到的耐药性木霉T2对代森锰锌的耐受性的20倍以上（EC50值为221 μg a.i.·mL-1），为突变木霉菌和代森锰锌联用奠定了基础；呋虫胺对两株突变株的菌丝生长EC50分别达到758.5 μg a.i.·mL-1和785.9 μg a.i.·mL-1，是市售推荐使用浓度的4倍以上；乙氧氟草醚对两株突变株的菌丝生长EC50分别达到198.2 μg a.i.·mL-1和200.3 μg a.i.·mL-1，达到市售推荐使用浓度。筛选结果表明，通过ARTP和药剂驯化培养的手段可以显著提高木霉菌对农药的抗性，在使用诱变木霉菌作为生防农药的农田，可以相应使用呋虫胺和乙氧氟草醚除虫除草。

对其他农药的耐药性测定表明，300 μg a.i.·mL-1的使用浓度下，噁霉灵对突变株的抑制率很小，木霉菌可以和噁霉灵混用防治植物病原真菌；在除草剂盖能草和草甘膦存在的环境中，木霉菌可以生长但生长速度受到明显的影响，生物拮抗能力可能被削弱；杀菌剂百菌清和杀虫剂快绝特对木霉菌株强烈抑制。对峙培养实验表明突变株稳定遗传亲本对植物病原菌的生物拮抗性，能使病菌菌丝停止生长，菌落消亡，培养6 d后木霉菌落覆盖的抗病等级均在Ⅰ、Ⅱ级。突变株较出发菌株对棉花黄萎病菌和马铃薯早疫病菌的差别不大，对峙培养6 d后木霉长满病菌菌落，但对核盘菌和棉花枯萎病菌的抑制率提高，同时突变株的生长繁殖能力和产β-1，3葡聚糖酶和几丁质酶的能力均高于出发菌株。生长速率快可以更快地占领生长空间、木霉产生的细胞壁降解酶可以降解病菌的细胞壁从而导致病原真菌不能正常生长，试验结果很好地说明了突变株拮抗能力提高的原因与其更高的生长速率和更强的产胞壁降解酶能力有关。突变株更优的抗药性和菌种特性使其比T. harzianum更能适应田间复杂的环境，具有良好的应用前景。但本试验的研究只处于初试阶段，并未对突变株活体植物拮抗能力以及菌药协同对植物抗病能力作用的影响进行探究。

4 结论

本研究采用常压室温等离子体诱变的方法，以含有杀虫剂（呋虫胺）、杀菌剂（代森锰锌）和除草剂（乙氧氟草醚）的复合含药培养基为筛子，成功筛选出上述3种农药有高度耐受性的突变型木霉菌株Th-3-36和Th-4-B，其对代森锰锌、呋虫胺和乙氧氟草醚的EC50分别达到5 000 μg a.i.·mL-1以上、750 μg a.i.·mL-1以上和190 μg a.i.·mL-1以上。抗药性菌株的生长繁殖能力与β-1，3葡聚糖酶、几丁质酶生产能力均优于出发菌株；对峙培养试验表明突变株稳定遗传亲本对植物病原菌的生物拮抗性，能使病菌菌丝停止生长，菌落消亡，菌落覆盖抗病等级均在I、Ⅱ级。

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（责任编辑 马鑫）

Mutagenesis of Trichoderma harzianum with Pesticide Mutipleresistance by Atmospheric and Room Temperature Plasma

Zhou Wenchen1Zhan Xiaobei1，2Zhu Li2Zheng Zhiyong1Wu Jianrong1
（1. Key Laboratory of Carbohydrate Chemistry and Biotechnology of Ministry of Education，School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi214122；2. Jiangsu Rayguang Biotechnology Co.，Ltd. Wuxi214125）

This study aimed to improve the adaptability of biocontrol Trichoderma in the complicated agricultural environment in where herbicides， insecticides， and fungicides co-exist. Trichoderma harzianum was used as initial strain and induced by atmospheric and room temperature plasma（ARTP）. The Trichoderma harzianum mutants resistant to both fungicides mancozeb and insecticide dinotefuran were obtained and one with the most double-resistance was named as Th-36. The mutant was subject to further mutation by ARTP and screened on the medium with mancozeb， dinotefuran and herbicide oxyfluorfen. Two mutants with triple-resistance were obtained and named as Th-3-36 and Th-4-B. The toxicity resistance test showed that EC50s of mancozeb for Th-3-36 and Th-4-B were up to 5089.2 μg a.i.·mL-1and 5498.2 μg a.i.·mL-1；for dinotefuran up to 758.5 μg a.i.·mL-1and 785.9 μg a.i.·mL-1；for oxyfluorfen up to 198.2 μg a.i.·mL-1and 200.3 μg a.i.·mL-1respectively. The above values were all higher than the average commercially recommended doses of these pesticides. The screened mutants showed the significant increasing resistance to pesticide， inherited parental broad-spectrum antibacterial property， and presented genetic stability. Furthermore growth capacity and enzyme characteristics of the mutants were better than those of the parental strains.

atmospheric and room temperature plasma（ARTP）； Trichoderma harzianum； pesticide resistance； domestication.

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.05.033

2014-10-18

国家自然科学基金项目（31171640，31271888），无锡市科技项目（CLE01N1208），无锡中小企业创新基金项目（CBE01G1344）

周文臣，女，硕士研究生，研究方向：发酵工程与农业生物技术；E-mail：717244030@qq.com

詹晓北，男，教授，博士生导师，研究方向：生化工程与反应器等研究；E-mail：xbzhan@yahoo.com