猪肉中四环素残留快速检测法的研究

鲍会梅

（江苏食品药品职业技术学院食品与营养工程学院，江苏淮安223003）

猪肉中四环素残留快速检测法的研究

鲍会梅

（江苏食品药品职业技术学院食品与营养工程学院，江苏淮安223003）

对猪肉样品的四环素残留量检测的研究。以高效液相色谱法（HPLC）检测猪肉组织中四环素残留，并对这种方法的提取及测定条件等方面进行了探讨。确定最佳提取条件是用5%高氯酸溶液25 mL提取样品中四环素残留，选择最佳测定条件是色谱柱为ODS-C18（6.2 mm×15 mm，5 μm），柱温为35℃，进样量为10 μL，波长为265 nm，流速为1.0 mL/min。

高效液相色谱法；猪肉；四环素

四环素是四环素类抗生素之一。而四环素类抗生素在化学结构上都属于氢化骈四苯环衍生物，并且在近可见区（270 nm附近）具有强紫外吸收，干燥条件下四环素族较稳定，但遇光易变色。在弱酸性溶液中相对稳定，在酸性溶液（pH＜2）、中性或碱性（pH＞7）均易发生降解而失效。在酸性条件下，易脱水，消除生成橙黄色脱水物，抗菌活性减弱或完全消失。在碱性条件下，生成具有内酯的异构体［1］。

四环素（Tetracycline，TC），又称去甲金霉素，分子式为C22H24N2O8，分子量444.45，是从放线菌金色链丛菌的培养液等分离出来的抗菌物质。黄色晶体，熔点170℃～175℃。微溶于水、乙醇和丙酮，在空气中稳定，但易吸收水分，受强日光照射变色。当人体中的四环素含量达到一定量时，可以对人体产生多种急慢性中毒，导致人体多种器官的病变［2］。在我国猪肉组织中四环素残留量最大限值为0.25 mg/kg［3］。

本文采用高效液相色谱法（HPLC）检测四环素在猪肉可食组织中四环素残留量［4］。此方法不仅操作简便，而且灵敏度和特异性高，可用于动物组织中四环素残留量的检测分析。

1　材料与方法

1.1试剂及配置

乙腈（分析纯）；0.01 mol/L磷酸氢二钠溶液；0.01 mol/L草酸甲醇溶液；0.01 mol/L三氟乙酸溶液；0.1 mol/L Na2EDTA-Mclivaine缓冲液平衡（pH=4.0）；四环素（TC）标准贮备液（1 mg/mL）；四环素标准使用液（10 mg/L）；5%高氯酸溶液；5%甲醇溶液。

猪肉：江苏省淮安市沃尔玛超市的冷鲜肉。

1.2主要仪器

Agilent1200高效液相色谱仪（HPLC），配有紫外检测器：美国Agilent公司；32R型离心机：德国HettichUNIVERAL公司；固相萃取装置：美国Waters公司。

1.3实验方法

1.3.1色谱条件

色谱柱：ODS-C18（6.2 mm×15 mm，5 μm）；柱温：30℃；进样量：10 μL；测波长：265 nm；流速：1.0 mL/min；流动相：乙腈-0.01 mol/L。

1.3.2样品提取方法的确定

样品的提取是指用适当的溶剂把待测组分从复杂样品基质中提取至易于净化和分析的液体状态。

1.3.2.1液-液萃取法

液-液萃取法是指被测物的性质在酸或碱性条件下提取净化［4］。该方法操作简便，但耗费时间，耗费有机溶剂，并且溶剂中容易引入新的杂质。还有的溶剂的大量挥发对实验人员健康会造成较大的危害，样品经多次转移浓缩会造成的分析误差较大，回收率较低。

1.3.2.2固相萃取法

固相萃取法是采用选择性吸附、选择性洗脱的方式对样品进行富集、分离、纯化。该方法与传统的液——液萃取法相比，具有明显的优势［5］。不仅提高了样品的处理通量，排除了基质对样品的影响能力，而且大大减少了溶剂的消耗，回收率高、重现性好，杂质干扰极低，易于实现自动化控制等，是目前兽药残留分析样品前处理中的主流技术。

1.3.2.3微波辅助萃取法

微波辅助萃取法是一种萃取速度快、溶剂用量少、回收率高、灵敏以及易于自动控制的新固态样品提取技术。该方法在回收率和重复性上优于其他萃取方法，同时不受含水量的影响，但此方法还未普及推广。

综合上述得，本文采用固相萃取法对猪肉进行提取为最佳提取方法。

1.3.3样品的制备

将猪肉切碎，于组织匀浆机中匀浆，备用。

1.3.4样品的提取

精确称取绞碎后的猪肉样品5.000 0 g，置于50 mL离心管中，涡旋，震荡，加入25 mL Na2EDTA-Mclivaine缓冲溶液提取，摇匀，再加入2 mL 0.01 mol/L三氯乙酸除去蛋白质，均质，以6 000 r/min离心10 min，过滤，再用25 mL Na2EDTA-Mclivaine缓冲溶液提取一次，过滤合并上清液。调上清液的pH至4.0，加入15 mL乙酸乙酯，6 000 r/min离心10 min，取上清液经中性快速滤纸过滤到100 mL锥形瓶中。离心管中残留物用10 mL Na2EDTA-Mclivaine缓冲液重复提取2次，振荡10min，在4℃下，以6 000 r/min离心10 min，一并过滤于锥形瓶中［8］。此为备用液，待净化。

1.3.5样品的净化

Oasis HLB固相萃取柱分别用5 mL甲醇、5 mL水预处理，保持柱体的湿润。再用0.1 moL/L Na2EDTAMclivaine缓冲液平衡，取备用液分次全部过同相萃取柱，待液体全部流出后用10 mL 5%甲醇溶液淋柱，在65 kPa减压抽干30 min。用10 mL 0.01 mol/L草酸甲醇溶液洗脱，收集洗脱液于锥形瓶中。

1.3.6工作曲线

取7个编号为1、2、3、4、5、6、7的25 mL比色管，分别加入四环素标准使用溶液0、0.125、0.25、0.5、1.25、2.5、5 mL（浓度为0.00、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00mg/L）。用0.01 mol/L草酸溶液定容至刻度。从低浓度到高浓度依次进样，每个浓度进样10 μL，以峰面积为纵坐标，以四环素的浓度为横坐标，绘制标准曲线。

1.3.7样品的测定

将收集在锥形瓶中的洗脱液，将其进行稀释，使之在曲线浓度范围内，用0.45 μm滤膜过滤，取溶液10 μL进样，记录峰面积，从工作曲线上查得四环素浓度，计算四环素的含量。

1.3.8结果计算

式中：X为试样中四环素的含量，（mg/kg）；C为标准曲线查得的试液中四环素的浓度，（mg/L）；V为样品定容体积，mL；m为试样质量，g。

根据公式和标准曲线图计算出测定的浓度，再经多次试验计算出回收率和精密度。

1.3.9猪肉中四环素残留的检测条件的探讨

在猪肉中四环素残留的检测条件不同对高效液相色谱法检测猪肉中四环素残留有一定的影响，本文就对样品的提取方法选择、检测波长的选择、提取液的选择、提取液pH的选择等进行讨论。

2　结果与分析

2.1猪肉中四环素残留的检测结果与分析

2.1.1标准曲线线性范围

按试验方法绘制标准曲线结果见表1和图1。

由图1得，四环素在0.05 mg/L～2 mg/L的浓度范围内有良好的线性关系，测定样品中四环素进样量的峰面积为262 822，根据图1得样品中四环素浓度（Cx）为1.26 mg/L。根据2.3.8公式计算样品中四环素的含量为0.126 mg/kg。

表1　四环素的进样量与峰面积Table 1The sample size and peak area of tetracycline

图1　标准曲线图Fig.1Standard diagram

2.1.2精密度试验

分别称取7份绞碎后的猪肉样品，在相同的检测条件下，根据上述样品测定方法在同样的条件下进行多次平行试验，实验结果如表2。

表2　精密度试验结果Table 2Results of precision test

通过对同一样品的重复性实验对该测定方法的精密度进行检测，实验结果表明其检测重复性好，精密度高，变T（min）、异系数分别为0.073%，0.83%，因此该精密度符合要求。

2.1.3样品回收率实验

采用标准加入法进行试验。在猪肉样品中添加一定量的四环素标准使用液进行回收率试验，实验结果如表3。

由表3可知：猪肉中四环素的平均回收率为91.1%。符合动物性食品中兽药残留试验技术规范和要求，所以该方法是可行的。

表3　猪肉中四环素的回收率试验结果Table 3Recovery of tetracycline from pork and the results of the test

2.2提取条件的探讨

2.2.1提取液的选择

称取同一份猪肉组织5.000 0 g，加入10 μg/mL的标准溶液50 μL，涡旋混匀后，分别加入Na2EDTAMclivaine缓冲液、5%高氯酸溶液、0.01mol/L草酸甲醇溶液3种不同提取液提取，把它们从固相萃取柱上洗脱下来。计算回收率，四环素的回收率见表4。

表4　提取液的选择Table 4Selection of extracts

由表4可见，在相同的条件下，Na2EDTA-Mclivaine缓冲液的提取率高于5%高氯酸溶液和0.01 mol/L草酸甲醇溶液提取液提取率，因此，采用Na2EDTAMclivaine缓冲液作为提取液。

2.2.2提取液pH的选择

以猪肉为考察对象，使用3种不同pH（3.0、4.0、5.0）的Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液的回收率试验，结果见表5和图2。

表5　提取溶液pH对四环素提取回收率的影响Table 5The effect of pH value of extraction solution on the recovery of tetracycline

图2　提取溶液pH的选择Fig.2The selection of the pH value of the solution

从表5和图2看出，在相同的条件下，在pH=4.0时，四环素回收率达到最大。故确定用pH=4.0的Na2EDTA-Mclivaine缓冲容液为提取液，溶液中的Na2EDTA能够掩蔽金属离子的干扰。

2.3色谱条件的最佳选择

2.3.1检测波长的选择

四环素分子内含有共轭双键系统，在紫外区有吸收，四环素在270 nm附近有较强的吸收，为了确定四环素的检测波长，对其200 nm～450 nm进行光谱扫描，四环素的紫外光谱扫描图见图3。

图3　四环素紫外-可见光谱图Fig.3Tetracycline UV Vis

从图3扫描图谱可以看出，四环素在220、235、265nm和355nm处有4个吸收峰，而在色谱测定中发现，在265 nm波长处，四环素的响应较大，吸收强度最好，即四环素的最佳波长为265nm，故本文采用265nm。

2.3.2柱温的选择

因为柱温太高，导致四环素差向异构化形成差向四环素；柱温太低，导致流动相粘度大，造成色谱峰拖尾，当柱温为25、30、35℃时进行色谱测定，结果见图4。

图4　四环素在不同的柱温条件下的色谱图Fig.4The chromatogram of tetracycline under different column temperature conditions

当柱温为40℃时，四环素差向异构化形成差向四环素，所以本文不选择柱温为40℃。由图4知：当柱温为35℃时，四环素的色谱峰没有拖尾故，本试验柱温选择35℃。

2.3.3流动相pH对分离效果的影响

分别配制pH=7.0，pH=4.0，pH=2.5的乙腈-0.01 mol/L磷酸二氢钠溶液的pH，观察不同的流动相对四环素和其他杂质的分离效果的影响，结果见表6。

表6　流动相pH对分离效果的影响Table 6The effect of mobile phase pH on separation effect

由表6知，pH=7.0和pH=4.0的情况下，四环素和其他杂质的分离效果不好，色谱柱对抗生素有较强的吸附作用，因此选择流动相的pH为2.5。

2.3.4流速的选择

流速大小直接影响色谱柱及其系统压力、各组分的分离时间。流速太慢，洗脱时间太长；流速太快，柱压太高，容易引起柱头塌陷，不利于色谱柱的长期使用。在流速分别为：1.0、1.5、2.0 mL/min时，流速对四环素洗脱时间、柱压的影响，结果见表7和图5，以确定最佳流速。

表7　流速对四环素洗脱时间、柱压的影响Table 7Effects of flow velocity on the elution time and column pressure of tetracycline

图5　流速对四环素洗脱时间、柱压的影响Fig.5The effect of flow velocity on the elution time and column pressure of tetracycline

由图5表明，当流速为1.0 mL/min时分离效果最佳。

3　结论

通过建立了高效液相色谱法（HPLC）检测猪肉组织中四环素残留的方法。最终得出以下结论：用5%高氯酸溶液25 mL提取样品中四环素残留，经0.1 mol/L Na2EDTA-Mclivaine缓冲液，0.01 mol/L草酸甲醇溶液净化。以乙腈0.01 mol/L磷酸二氢钠溶液（30%硝酸溶液调节pH2.5）75∶25为流动相，色谱柱为ODS-C18（6.2 mm×15 mm，5 μm，柱温为35℃，进样量为10 μL，测波长为265 nm，流速为1.0 mL/min。通过实验可知，本文建立一种方法简便、快速、重复性好、准确度高的高效液相色谱法，是猪肉中四环素残留快速检测的有效方法。本方法对样品前处理方法进行改进，使各色谱峰避免受杂质峰的干扰，得到良好的分离，保留时间稳定，线性范围好，能满足猪肉中四环素残留检测的分析要求，具有实际应用价值。

［1］岳振峰，郑卫平，谢丽琪，等.高效液相色谱法测定动物组织中四环素类抗生素残留量的研究［J］.分析实验室，2006（10）：24

［2］吉彩霓，岳振峰，谢丽琪，等.高效液相色谱法同时检测水产品中7种四环素类抗生素残留的研究［A］.中国兽医科技，2005，35（10）：820

［3］尹凯丹，张奇志.食品理化分析［M］.北京：化学工业出版社，2008：228-229

［4］丁明洁，张春晖.仪器分析［M］.北京：化学工业出版社，2010：93

［5］中国国家标准化管理委员会.GB/T 5009.116-2003畜、禽肉中土霉素、四环素、金霉素残留量的测定（高效液相色谱法）［S］.北京：中国标准出版社，2003，50-229

［6］中国国家标准化管理委员会.GB/T20764-2006可食动物肌肉中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素残留量的测定（液相色谱-紫外检测法）［S］.北京：中国标准出版社，2006：6-22

［7］陈蔷.动物源食品中四环素类抗生素残留高效液相色谱检测方法的研究［J］.河南农业大学，2009（5）：33

Pork in Tetracycline Residues Rapid Detection Method Research

BAO Hui-mei
（Jiangsu Food Vocational Technical College of Engineering Food and Nutrition，Huai'an 223003，Jiangsu，China）

Based on the high performance liquid chromatography（HPLC）detection of tetracycline residues in pork tissue，and the methods of extraction and determination conditions were discussed.To determine the optimal extraction conditions for 5%perchloric acid solution 25 mL extraction samples tetracycline residues，and the optimal conditions for the determination was a chromatographic column for ODS-C18（6.2 mm×15 mm，5 μm，35℃），column temperature，amount of sample was 10 μL，265 nm wavelength，the flow rate of 1.0 mL/min，the experimental detection of pork samples study on the residues of tetracycline.

high performance liquid chromatography；pork；tetracycline

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.13.030

2013-12-12

鲍会梅（1974—），女（汉），副教授，硕士，主要从事食品理化检验教学工作。