鲫鱼卵唾液酸糖蛋白对免疫功能低下小鼠的免疫调节作用

周晓春，于 哲，毛 磊，赵延蕾，王一名，王静凤

（中国海洋大学食品科学与工程学院，山东青岛266003）

鲫鱼卵唾液酸糖蛋白对免疫功能低下小鼠的免疫调节作用

周晓春，于 哲，毛 磊，赵延蕾，王一名，王静凤*

（中国海洋大学食品科学与工程学院，山东青岛266003）

从鲫鱼卵中提取唾液酸糖蛋白，并探讨其对免疫功能低下小鼠免疫功能的作用。Balb/c小鼠连续皮下注射氢化可的松造成免疫功能低下模型，以不同剂量的鲫鱼卵唾液酸蛋白灌胃28d后，分别测定小鼠的抗体产生水平、T细胞免疫功能、非特异性免疫功能和血清IFN-γ/IL-4。结果显示，高剂量的鲫鱼卵唾液酸糖蛋白能显著升高免疫低下小鼠的血清溶血素水平（p＜0.01）和抗体细胞生成数（p＜0.01），增强脾淋巴细胞增殖能力（p＜0.01）和迟发型变态反应（p＜0.05），显著提高腹腔巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬率和吞噬指数（p＜0.01），改善碳廓清能力（p＜0.05）并升高血清中IFN-γ/IL-4水平（p＜0.01）。说明鲫鱼卵唾液酸糖蛋白对免疫功能低下小鼠具有显著的免疫调节作用。

鲫鱼卵唾液酸糖蛋白，血清溶血素，脾淋巴细胞转化，迟发型变态反应，IFN-γ/IL-4

鱼卵是鱼类加工过程中产生的重要副产物，目前除少量优质鱼卵被用来加工为腌渍鱼卵、鱼子酱等初级食品形式外，大部分未被充分利用，造成了资源浪费。而鱼卵含有生命体发育所需的全部营养成分，其营养价值很高。研究表明鱼卵主要成分为蛋白质、脂质和矿物质，其中卵黄蛋白是主要成分，包括卵黄高磷蛋白、卵黄脂磷蛋白和β′组分［1-2］，富含糖蛋白组分。但目前对鱼卵功效成分的研究主要集中在功能性脂质部分，而对鱼卵中糖蛋白组分的研究尚未见报道。

本课题组前期经筛选研究发现，鲫鱼卵中唾液酸含量丰富，从鲫鱼卵中提取的唾液酸糖蛋白具有促进成骨细胞增殖的活性。另有研究报道，富含唾液酸糖蛋白的燕窝匀浆可以有效改善免疫低下小鼠的免疫功能，其免疫功能与唾液酸糖蛋白组分有关［3-4］。因此本研究以高唾液酸含量的鲫鱼卵糖蛋白为研究对象，观察了其对免疫功能低下小鼠的免疫调节作用，为鱼卵资源的深度开发和综合利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜鲫鱼 体重约0.5kg，处于鱼卵成熟期，购于青岛市大连路水产品市场；BALB/c小鼠 雄性，4～6周龄，体重17～19g，SPF级，北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物合格证号SCXK（京）-20120001；成年豚鼠 雌性，体重400～500g，山东鲁抗制药有限公司提供，动物证号SCXK（鲁）-20030006，抽取其心血，常规分离血清，以压积的绵羊红细胞吸收后，作为本实验的补体；健康公鸡 购于青岛市南山市场，抽取鸡翼静脉血，按常规方法制备鸡红细胞（Chicken red blood cell，CRBC）；N-乙酰神经氨酸（N-acetylneuram inicacid，NAG）、刀豆蛋白（ConA）、噻唑蓝［（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT］美国Sigma公司；绵羊红细胞 济南万德广联医疗器械有限责任公司提供；氢化可的松注射液 西安利君制药有限责任公司；盐酸左旋咪唑 山东省莒南制药厂；印度墨汁 北京笃信精细制剂厂产品；IFN-γ、IL-4 ELISA试剂盒 武汉博士德生物技术有限公司。

Aglient1100型高效液相色谱仪 美国Aglient公司；ALPHA1-4LD型冷冻干燥机 德国CHRIST公司；MR-23i型高速冷冻离心机 法国Jouan公司；LABOROTA4000型旋转蒸发仪 德国Heidolph公司；680型酶标仪 美国Bio-Rad公司；2711型CO2培养箱 德国Heraeus公司；120型正置生物显微镜 日本Olympus公司；TGL-16G型台式离心机 上海安亭科学仪器厂；镀铬游标卡尺（精度0.02mm） 江西工具厂。

1.2 实验方法

1.2.1 鲫鱼卵唾液酸糖蛋白的制备 新鲜鲫鱼，分离鱼卵，低温下剔除卵巢膜后高速搅拌破碎，冷冻干燥处理后，以15倍体积的95%乙醇脱脂12h，冷风干燥后得脱脂鱼卵。脱脂鱼卵以蒸馏水（脱脂鱼卵/水= 1/30，V/V）搅拌提取两次，8000r/m in低温离心20m in，上清液合并后于45℃旋转蒸发浓缩后冷冻干燥，得鲫鱼卵唾液酸糖蛋白。参照文献方法［5］，以NAG为标准品、DAD串联HPLC法测得其唾液酸含量为5.89%± 1.11%，Folin-酚法测得其蛋白含量为34.51%±2.00%，苯酚-硫酸法测得其粗多糖含量为6.06%±0.07%。

1.2.2 动物分组与模型建立 BALB/c小鼠，适应性喂养7d后，按体重随机分为正常对照组（N），模型对照组（M），阳性对照组（P）和鲫鱼卵唾液酸糖蛋白低、高剂量组（JL，JH），每组10只。剂量组小鼠灌胃不同浓度的鲫鱼卵唾液酸糖蛋白溶液（10、50mg/kg·bw）。阳性对照组灌胃左旋咪唑（20mg/kg·bw），正常和模型对照组灌胃生理盐水，灌胃体积10m L/kg·bw，1次/d，连续28d。于首次给药后的第21d，正常对照组除外，其余各组小鼠均于颈部皮下注射氢化可的松（23mg/kg·bw），每天1次，连续7d，建立免疫功能低下小鼠模型，正常对照组注射等量生理盐水。

1.2.3 血清溶血素的测定 首次给药第23d时，各组小鼠腹腔注射0.2m L 5%（体积分数，以下SRBC的百分浓度均指体积分数）SRBC致敏。末次灌胃给药后，摘眼球取血，分离血清。按血清∶生理盐水=1∶100稀释后，参考文献方法［6］测定血清溶血素含量，计算半数溶血值（HC50）。

1.2.4 抗体生成细胞数的测定 小鼠致敏方法同1.2.3，末次给药后，脱颈椎处死。无菌取脾，以RPM I-1640培养基制备脾细胞悬液（浓度为107个/m L）。于冰浴中，各试管依次加入脾细胞悬液、0.4%SRBC、1∶15豚鼠血清各0.5m L（对照管以生理盐水代替脾细胞悬液），37℃水浴60m in，冰浴终止反应，3000r/m in离心5m in，上清液于450nm处测吸光值A。

1.2.5 迟发型变态反应（足跖增厚法）的测定 参照文献方法［7］测定，以足跖增厚法来检测小鼠的迟发型变态反应。小鼠致敏方法同1.2.3，致敏4d后，分别测量各组小鼠左后足跖厚度。测量部位足跖再次注射20μL 20%SRBC进行第二次致敏，24h后测量其厚度，并计算2次致敏前后足跖的厚度差值。

1.2.6 脾T淋巴细胞增殖能力的测定 于末次给药后，小鼠脱颈椎处死。无菌取脾，制备小脾细胞悬液，脾T淋巴细胞转化的测定方法参考文献［7］。其中，脾淋巴细胞的接种浓度为5×106个/m L，ConA的终浓度为5μg/m L。于570nm处测定吸光值，脾淋巴细胞的增殖能力以加和不加ConA的吸光值的差值表示。

1.2.7 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力的测定 于末次给药后禁食不禁水12h，每只小鼠腹腔注射1m L 2%（体积分数）鸡红细胞悬液，30min后脱颈椎处死。小鼠腹腔巨噬细胞的收集、染色和计数参见文献方法［6］，计算吞噬百分率和吞噬指数。

1.2.8 小鼠碳廓清能力的测定 末次给药12h后，称重。尾静脉注射印度墨汁（以生理盐水按1∶4稀释），注射体积0.1m L/10g·bw。碳廓清能力测定方法参照文献［6］。并计算小鼠巨噬细胞对血液内碳粒的吞噬指数。

1.2.9 血清IL-4和IFN-γ含量的测定 于末次给药后，禁食不禁水12h，摘眼球收集血液，常规分离血清，参照ELISA试剂盒方法分别检测血清IFN-γ和IL-4含量。

1.着重学习过程当中的评价。在学习过程中，学生的各方面能力都会得到不同程度的锻炼，学生的创新意识也会展现，所以对过程的评价很重要。

1.2.10 统计学分析 采用SPSS11.0软件进行单因素方差分析，同时进行LSD两两比较，以p＜0.05为具有统计学意义上的差异。所有实验结果均用（±s）表示。

2 结果与分析

2.1 对抗体水平和抗体细胞生成数的影响

血清溶血素水平和抗体细胞生成数代表了小鼠体内抗体生成细胞的抗体产生水平，反映了体液免疫功能［8］。血清溶血素以半数溶血值HC50表示。由表1可以看出，模型对照组小鼠的HC50和抗体细胞生成数比正常组分别下降了27.84%和58.24%（p＜0.01），表明模型建立成功。相比模型对照组，高剂量的鲫鱼卵唾液酸糖蛋白可显著提高免疫功能低下小鼠的血清溶血素水平和抗体细胞生成数。其中高剂量组的HC50提高了36.21%（p＜0.01），抗体细胞生成数提高了37.16%（p＜0.01）。说明高剂量的鲫鱼卵唾液酸糖蛋白对模型小鼠的体液免疫功能有显著的改善作用。

表1 鲫鱼唾液酸糖蛋白对小鼠抗体细胞生成数、足跖增厚值和脾淋巴细胞转化的影响（n=10，±s）Table 1 Effects of sialoglycoprotein in eggs of Carassius auratus on HC50，Number of antibody-forming cells，DTH and T-cell transformation in immunocompromized mice（n=10，±s）

表1 鲫鱼唾液酸糖蛋白对小鼠抗体细胞生成数、足跖增厚值和脾淋巴细胞转化的影响（n=10，±s）Table 1 Effects of sialoglycoprotein in eggs of Carassius auratus on HC50，Number of antibody-forming cells，DTH and T-cell transformation in immunocompromized mice（n=10，±s）

注：#p＜0.05，##p＜0.01，与正常组比；*p＜0.05，**p＜0.01，与模型组比；表2、表3同。

组别 半数溶血值 抗体细胞生成数 足跖增厚值（mm） 脾淋巴细胞转化正常组 76.12±5.93 0.261±0.004 0.42±0.03 0.124±0.014模型组 54.93±7.15## 0.109±0.007## 0.32±0.08# 0.069±0.008##阳性组 69.41±4.21** 0.100±0.007** 0.41±0.08* 0.112±0.010**低剂量组 63.84±6.06 0.101±0.003 0.31±0.07 0.076±0.004高剂量组 74.82±5.46** 0.150±0.009** 0.40±0.08* 0.105±0.020**

2.2 对脾T淋巴细胞增殖能力和迟发型变态反应的影响

脾T淋巴细胞的增殖能力和迟发型变态反应可以反映小鼠的T细胞免疫功能［9］。与正常对照组相比，模型对照组的脾T淋巴增殖能力降低了43.83%（p＜0.01），足趾增厚值降低了23.79%（p＜0.05）。经鲫鱼卵唾液酸糖蛋白干预后，模型小鼠的T细胞增殖能力和足跖增厚值均有所提高。由表1可知，高剂量组的T细胞增殖能力和足跖增厚值分别提高了51.02%（p＜0.01）和24.86%（p＜0.05）。表明高剂量的鲫鱼卵唾液酸糖蛋白可以显著改善免疫功能低下小鼠的细胞免疫功能。

腹腔巨噬细胞的吞噬能力可以衡量小鼠体内单核-巨噬细胞的免疫功能，体现了非特异性免疫功能［10］。由表2可知，模型对照组小鼠的吞噬百分率和吞噬指数分别下降了25.50%和23.30%（p＜0.01）。灌胃鲫鱼卵唾液酸糖蛋白后，小鼠腹腔巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬百分率和吞噬指数均显著提高（p＜0.01）。数据显示，高剂量组的吞噬百分率和吞噬指数分别提高了25.05%和22.22%（p＜0.01）。说明鲫鱼卵唾液酸糖蛋白对免疫低下小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能有显著改善作用。

2.4 对小鼠碳廓清能力的影响

小鼠血清内碳粒的廓清速率可以反映小鼠体内整个单核-巨噬细胞系统的吞噬功能［8］。由表2可以看出，与正常对照组相比，模型对照组小鼠的碳粒吞噬指数降低了20.00%。以鲫鱼卵唾液酸糖蛋白灌胃后，高剂量组小鼠比模型组小鼠的碳粒吞噬指数升高了15.19%（p＜0.05），吞噬率提高了25.05%（p＜0.01）。

表2 鲫鱼卵唾液酸糖蛋白对小鼠吞噬百分率、吞噬指数和碳廓清能力的影响（n=10±s）Table 2 Effects of sialoglycoprotein in eggs of Carassius auratus on phagocytic rate，phagocytic index and ablity ofcarbon clearance in immunocompromized mice（n=10，±s）

表2 鲫鱼卵唾液酸糖蛋白对小鼠吞噬百分率、吞噬指数和碳廓清能力的影响（n=10±s）Table 2 Effects of sialoglycoprotein in eggs of Carassius auratus on phagocytic rate，phagocytic index and ablity ofcarbon clearance in immunocompromized mice（n=10，±s）

组别 吞噬百分率（%） 吞噬指数 碳廓清能力正常组 53.26±0.46 1.76±0.01 5.17±0.44模型组 39.28±0.66## 1.35±0.05## 4.14±0.78##阳性组 44.32±2.15** 1.59±0.07** 5.00±0.70*低剂量组 39.73±0.84 1.44±0.08 4.56±0.43高剂量组 49.12±1.58** 1.65±0.08** 4.76±0.14*

2.5 对血清IL-4和IFN-γ水平的影响

血清IFN-γ和IL-4分别是Th1和Th2细胞分泌的细胞因子，Th1细胞介导细胞免疫，Th2细胞介导体液免疫。IFN-γ/IL-4比值，可间接反映Th1/Th2的平衡状态，是评价机体免疫状态的综合指标［11-12］。由表3可以看出，相比于正常对照组，模型对照组小鼠血清IL-4水平显著上升（p＜0.01），IFN-γ/IL-4显著降低（p＜0.01），表明模型组小鼠体内Th1/Th2动态平衡向Th2漂移，处于免疫抑制状态。灌胃鲫鱼卵唾液酸糖蛋白后，高剂量组IL-4比模型组小鼠降低了27.72%（p＜0.01），而IFN-γ/IL-4值比模型组小鼠升高了34.16%（p＜0.01）。表明鲫鱼卵唾液酸糖蛋白可以活化Th1细胞，促进Th1/Th2回复到平衡状态。

表3 鲫鱼卵唾液酸糖蛋白对小鼠INF-γ，IL-4和IFN-γ/IL-4的影响（n=10，±s）Table 3 Effects of sialoglycoprotein in eggs of Carassius auratus on IFN-γ，IL-4 and IFN-γ/IL-4 in immunocompromized mice（n=10±s）

表3 鲫鱼卵唾液酸糖蛋白对小鼠INF-γ，IL-4和IFN-γ/IL-4的影响（n=10，±s）Table 3 Effects of sialoglycoprotein in eggs of Carassius auratus on IFN-γ，IL-4 and IFN-γ/IL-4 in immunocompromized mice（n=10±s）

组别Group IFN-γ（pg/mL） IL-4（pg/mL） IFN-γ/IL-4正常组 425.07±11.84 77.25±12.07 5.34±0.63模型组 434.21±14.85 103.49±7.31## 4.21±0.32##阳性组 429.39±20.00 85.46±11.91** 5.10±0.69*低剂量组 431.05±31.49 93.02±7.31** 4.66±0.51高剂量组 420.61±34.95 74.80±4.76** 5.65±0.69**

3 结论与讨论

机体的免疫系统包括具有免疫功能的器官、组织和分子等，分为特异性免疫和非特异性免疫。本研究主要从特异性免疫及非特异性免疫功能等方面评价鲫鱼卵唾液酸糖蛋白对机体免疫功能的调节作用。实验结果显示，鲫鱼卵唾液酸糖蛋使血清溶血素含量显著提高了36.21%（p＜0.01），使抗体细胞生成数提高了37.21%（p＜0.01），并可显著改善T细胞介导的迟发型变态反应、促进脾T细胞增殖，说明其能增强免疫低下小鼠的特异性免疫。同时，鲫鱼卵唾液酸糖蛋白使巨噬细胞的吞噬指数和吞噬率分别显著提高了25.05%和22.22%（p＜0.01），说明免疫功能低下小鼠的非特异性免疫功能被显著改善。血清IFN-γ/ IL-4的升高表明其可以显著逆转免疫机能低下小鼠体内Th1/Th2的漂移，增强细胞免疫功能。

Matsuda等研究发现，鸡蛋中的糖蛋白可以增强机体免疫力［13］。糖蛋白增强免疫调节能力的机理被认为是糖蛋白中特定的寡糖具有作为专一信息载体的能力而影响淋巴细胞的许多功能，包括有机体中细胞有丝分裂原的激活作用、细胞对毒素的反应和淋巴细胞对靶器官的作用等［14］。本研究的结果表明鲫鱼卵中含有唾液酸的糖蛋白在50mg/kg·bw的剂量下，对免疫功能低下小鼠具有全面的免疫促进作用，所以鲫鱼卵唾液酸糖蛋白可以作为免疫增强剂。但是唾液酸糖蛋白的结构和具体的免疫增强机制及其关系还需进一步着重研究和深入探讨。

［1］Matsubara T，Ohkubo N，Andoh T，et al.Two forms of vitellogenin，yielding two distinct lipovitellins，play different roles during oocyte maturation and early development of barfin flounder，Verasper moseri，a marine teleost that Spawns pelagic eggs［J］.Developmental Biology，1999，213：18-32.

［2］Mewes KR，Latz M，Golla H，et al.Vitellogenin from female and estradiol-stimulatedmale river Lampreys（Lampetra fluviatilis L）［J］.The Journal of experimental zoology，2002，292：52-72.

［3］曹妍，徐杰，王静凤，等.印尼白燕窝对免疫低下模型小鼠免疫调节作用的研究［J］.营养学报，2012，34（2）：168-171.

［4］张能荣.燕窝的成分和药理研究概况［J］．中国生化药物杂志，1993，66：6-10.

［5］冯婷玉，薛长湖，孙通，等.燕窝中唾液酸的DAD/FLD串联HPLC测定方法研究［J］.食品科学，2010，31（8）：233-236.

［6］卫生部卫生法制与监督司.保健食品检测与评价技术规范（2003年版）［S］.北京：人民卫生出版社，2003，27-29.

［7］徐淑云，卞如濂，陈修.药理实验方法学［M］.北京：人民卫生出版社，1982：936-937.

［8］李八方.功能食品与保健食品［M］.青岛：青岛海洋大学出版社，1997：224.

［9］雷敏.鱿鱼墨黑色素及黑色素铁生物活性研究［D］.青岛：中国海洋大学，2008.

［10］李八方，徐杰，赵雪.海洋生物活性物质［M］.青岛：中国海洋大学出版社，2007.

［11］YAMAZAKI K，YANO T，KAMEYAMA T.Clinical significance of serum TH1/TH2 cytokines in patients with pulmonary adenocarcinoma［J］.Surgery，2002，131（1SuPP1）：S236－S241.

［12］贺敏，胡世伟，吴胜强，等.高含量EPA/DHA甘油三酯型鱼油对小鼠的免疫调节作用［J］.中国海洋药物，2013，32（3）：1-7.

［13］Matsuda T，Wanabe K，Nakajmura R.Immunochemieal and physical properties of peptic-digested ovomueoid［J］.J.Agric. FoodChem.，1983，93，661-668.

［14］阚建全.甘薯糖蛋白的糖链结构与保健功能研究［D］.重庆：西南农业大学，2003.

Immunomodulatory effects of sialoglycoprotein in eggs ofCarassius auratus on immunocompromized mice

ZHOU Xiao-chun，YU Zhe，MAO Lei，ZHAO Yan-lei，WANG Yi-m ing，WANG Jing-feng*
（College of Food Science and Engineering，Ocean University of China，Qingdao 266003，China）

Sialoglycoprotein was extracted from eggs of Carassius auratus，and its immunomodulatory effects onimmunocompromized mice were studied. Different dosage of sialoglycoprotein from eggs of Carassius auratuswas given to immunodepressive model mice induced by Hydrocortisone for 28d. The antibody level ，immunological function of T cell and level of serum interferon-γ （IFN-γ） and interleukin-4 （IL-4） wasmeasured. Results showed that high -dose of sialoglycoprotein could increased the hemolysin content andnumbers of antibody-forming cells（p＜0.01） and strengthened lymphocyte proliferation（p＜0.01） significantly. Itcould aslo increase toe incrassation（p＜0.01） and promote phagocytosis ability of celiac macrophage（p＜0.05）and serum IFN-γ/IL-4（p＜0.01） markedly. Data suggested that the sialoglycoprotein from Carassius auratushad significant immunomodulatory effects on immunocompromized mice.

sialoglycoprotein from eggs of Carassius auratus ；hemolysin ；spleen lymphocyte transformation ；delayed-type hypersensitivity；IFN-γ/IL-4

TS201.4

A

1002-0306（2015）08-0340-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.08.062

2014－07－17

周晓春（1989-），女，硕士研究生，研究方向：海洋生物活性物质。

*通讯作者：王静凤（1964-），女，博士，教授，研究方向：海洋生物活性物质。

国家自然科学基金（31371876）；山东省自主创新专项项目（2012CX80201）。