分散固相萃取-气相色谱法同时测定水产品中六种丁香酚类麻醉剂的残留量

陈 焕，黄 和，*，高 平，杨嘉丽，黄国方，刘文侠

（1.广东海洋大学食品科技学院，广东省水产品加工与安全重点实验室，水产品深加工广东普通高等学校重点实验室，广东湛江524088；2.国家海产品质量监督检验中心（湛江），广东湛江524094）

分散固相萃取-气相色谱法同时测定水产品中六种丁香酚类麻醉剂的残留量

陈 焕1，黄 和1，*，高 平2，杨嘉丽2，黄国方2，刘文侠2

（1.广东海洋大学食品科技学院，广东省水产品加工与安全重点实验室，水产品深加工广东普通高等学校重点实验室，广东湛江524088；2.国家海产品质量监督检验中心（湛江），广东湛江524094）

建立了同时检测水产品中六种丁香酚类麻醉剂残留量的分散固相萃取-气相色谱检测方法。样品经丙酮进行提取，旋转蒸发浓缩后定容，采用分散固相萃取（DSPE）净化，用气相色谱仪进行测定，外标法定量。六种丁香酚类化合物在0.05～10.0μg/mL的浓度范围内线性关系良好，相关系数R2为0.9995～0.9999。又分别在罗非鱼、南美白对虾、鳗鲡以及梭子蟹肌肉样品中添加0.1～1.0mg/kg的混合标准溶液，测定平均回收率在80.3%～103.2%范围内，相对标准偏差在0.7%～5.4%之间。方法的定量限（LOQ），六种丁香酚类化合物（丁香酚、甲基丁香酚、异丁香酚、甲基异丁香酚、乙酸丁香酚酯、乙酰基异丁香酚）均为0.1mg/kg。

气相色谱，分散固相萃取，水产品，丁香酚类，残留量

丁香酚、甲基丁香酚、异丁香酚、甲基异丁香酚、乙酸丁香酚酯、乙酰基异丁香酚均属于丁香酚类化合物，因其在渔用麻醉方面较其他麻醉剂具有成本低、效果好、残留期短等特点［1-2］，而近年来受较多关注。澳大利亚、新西兰、智利等国家已把丁香酚类化合物列为没有残留期的合法水产品麻醉剂。而美国国家毒理学计划（NTP）发布的毒理学数据显示，丁香酚类化合物对啮齿动物是致癌物或潜在的致癌物，其安全性值得怀疑。日本肯定列表中丁香酚类化合物在水产品中的最高残留量也都有限制，而我国对丁香酚类化合物残留方面的限制目前还处于空白阶段。因此，亟需建立水产品中多种丁香酚类化合物的简便、高效、准确的样品前处理方法和仪器定量、验证方法。

目前，国内外报道丁香酚类化合物的检测多为生物样品、食品以及一些药品，主要有HPLC法［3-4］、GC法［5-6］、GC-MS［7-8］、TLC法［9］和毛细管电泳法［10］等，这些方法前处理较简单，大多直接用有机提取溶剂进行提取后上机检测，检出限和定量限都较高，无法满足复杂的水产品基质中残留限量的要求。分散固相萃取（QuEChERS）是2003年提出的一种快速、简单、低成本的样品前处理方法［11］，与传统的固相萃取的方法相比，省去了淋洗、洗脱、转溶、乳化浓缩而造成的目标物的损失。国内外报道的已有很多种药物残留可用该方法进行分析，但将此方法应用于水产品中丁香酚类麻醉剂的残留分析尚未报道。本研究以常见的几种水产品为基质，运用气相色谱法检测其中六种丁香酚类化合物残留，旨在建立一种能同时检测水产品中六种丁香酚类麻醉剂的简便、准确、灵敏的方法，为以后相关标准的制定提供参考依据。

1 材料与方法

罗非鱼、南美白对虾、鳗鲡和梭子蟹 均由湛江市国联水产有限公司提供，实验前，将活罗非鱼、鳗鲡洗净去皮、去鳞取可食用肌肉部分，用刀片将其切成大小为0.5cm×0.5cm×0.5cm小块，南美白对虾、梭子蟹去壳、去头，取净肌肉部分，然后用组织匀浆机把样品绞碎混匀，分别标记并装入样品袋中，放入-18℃下冰箱中保存备用，实验时将其从冰箱中拿出自然解冻至室温；丁香酚（CAS号：97-53-0）、甲基丁香酚（CAS号：93-15-2）、异丁香酚（CAS号：97-54-1）、甲基异丁香酚（CAS号：93-16-3）、乙酸丁香酚酯（CAS号：93-28-7）、乙酰基异丁香酚（CAS号：93-29-8）标准品 上海安谱科学仪器有限公司，纯度均为97%；丙酮、正己烷、无水乙醇、无水乙醚、氯化钠 广东光华科技股份有限公司，均为分析纯；无水硫酸钠、无水硫酸镁（实验前600℃下灼烧4h，放于干燥器中冷却） 天津大茂化学试剂厂，均为分析纯；N-丙基乙二胺吸附剂（PSA）、十八烷基键合硅胶（C18）吸附剂、石墨化碳黑（GCB） 德国CNW科技公司。

GC-2010 Plus气相色谱仪 日本岛津公司；VTX 3000L漩涡混匀器 日本EYELA；Heraeus马弗炉 美国Thermo公司；HR2860组织匀浆机 珠海飞利浦；R-2旋转蒸发仪（配国产冷凝水循环系统，水温设置为5℃） 瑞士BUCHI；SIGMA 3-18K高速冷冻离心机 德国；TDL-5-A台式离心机 上海安亭科学仪器厂；LE-500A分析天平 佛山广华天力天平厂；XS-205电子分析天平 瑞士METTLER-TOLEDO公司；HU3120B超声波清洗器 天津恒奥。

1.2 实验方法

1.2.1 样品前处理

1.2.1.1 提取 准确称取5g（精确到0.01g）已处理好的样品，放于准备好的50m L塑料离心管中，然后加入5g经灼烧的无水硫酸钠、3g氯化钠、15m L丙酮，盖紧塑料旋塞，摇匀振荡2min后，12000r/min均质60s，以4000r/m in冷冻离心机离心10m in，吸出上清液于100m L鸡心瓶中；残渣再加入15m L丙酮重复上述步骤提取，4000r/m in离心，合并上清液，40℃旋转蒸发至约0.5m L左右。

1.2.1.2 净化 加入混合溶液（乙酸乙酯∶正己烷= 1∶1，v/v）溶解残余物并转移到10m L玻璃离心管中，准确定容至4m L于漩涡振荡器上振荡1m in，静置。准确量取2m L上述溶液于事先准备好的装有300mg无水硫酸镁、75mgPSA、75mg C18以及15mgGCB的10m L玻璃试管中，漩涡振荡1～2min后4000r/min离心5min，取上层溶液过0.45μm有机滤膜，供气相色谱仪分析。

1.2.2 色谱条件 色谱柱：ZB-1701毛细管色谱柱（30m×0.25mm×0.25μm）；进样口温度：230℃；程序升温：柱温初始为80℃保持1min，然后以10℃/min升至200℃，保持4m in，再以20℃/m in升至230℃，保持10m in；检测器及温度：FID检测器，300℃；载气：高纯氮气；进样模式：不分流进样；进样量：1μL。

1.2.3 标准溶液的配制 分别准确称取0.100g（精确至0.0001g）丁香酚、甲基丁香酚、异丁香酚、甲基异丁香酚、乙酸丁香酚酯、乙酰基异丁香酚六种标准品，用混合溶剂（乙酸乙酯∶正己烷=1∶1，v/v）分别溶解于棕色容量瓶中并定容到100m L，配制成1000μg/m L标准储备液，放于-18℃冰箱保存，有效期6个月。使用时用混合溶剂（乙酸乙酯∶正己烷=1∶1，v/v）将储备液稀释成所需要的浓度作为标准溶液。

泰州大桥除了针对桥梁设施安全等重点关注部位和养护作业、排障作业等重点关注作业外，还应用长大桥隧设施及运营安全监测预警与应急管理系统、长大桥隧视频拼接检测系统、长大桥隧灾情推演及应急管理系统等先进技术，在服务区、收费站等非重点关注部位设置风险告知牌，实现了风险的可视化呈现.

1.2.4 样品加标回收率实验 称取不含六种丁香酚类化合物的空白样品后，加入适量的六种混合丁香酚标准工作液，于室温下静置30m in后按1.2.1样品前处理方法处理样品及1.2.2色谱条件进样分析，以保留时间定性，外标法定量。

2 结果与讨论

2.1 提取溶液的选择

丁香酚类化合物（丁香酚、甲基丁香酚、异丁香酚、甲基异丁香酚、乙酸丁香酚酯、乙酰基异丁香酚）属于极性或者弱极性化合物，几乎不溶于水，易溶于乙醇、乙醚等有机溶剂。根据参考文献报道［12-17］，有采用正己烷、无水乙醇、甲醇、丙酮、无水乙醚等作为丁香酚含量测定的提取溶剂。因此，本实验研究了常用的正己烷、无水乙醇、丙酮和无水乙醚四种有机溶剂作为提取溶剂对六种丁香酚类化合物的提取效果影响。并在空白对虾肌肉中添加浓度为2.0μg/m L的混合标准溶液，按照1.2.1的前处理方法处理样品后，上机测定，同时计算平均回收率和精密度，结果见表1。

从表1可以看出，无水乙醚提取时，溶液颜色较深，杂质干扰较多且基线噪音较大，影响了检测的灵敏度；虽然经正己烷提取后溶液颜色较浅，杂质干扰少且基线较平稳，但乙酸丁香酚酯和乙酰基异丁香酚的平均回收率较低，影响了检测效果；丙酮、无水乙醇提取后平均回收率都较高且相差不大，但丙酮作为提取剂时，溶液颜色稍浅，杂质干扰和基线噪音都优于无水乙醇，而且在提取溶液浓缩的过程中，丙酮的浓缩速度也较无水乙醇快，节省了前处理的时间。因此，本实验采用丙酮作为六种丁香酚类化合物的提取溶剂。对虾样品中四种不同提取溶剂的提取效果色谱图如图1所示。

图1 无水乙醚（a）、正己烷（b）、丙酮（c）、无水乙醇（d）四种提取溶剂提取色谱图Fig.1 The chromatogram of four kinds of extraction solvent by Anhydrous ether（a），hexane（b），acetone（c），ethanol（d）

2.2 提取方式的选择

实验研究了漩涡振荡、均质、超声提取三种提取方法对对虾肌肉中六种丁香酚类化合物的提取效果的影响，结果见表2。三种提取方法所得到的平均回收率都较高，且峰形均较好，杂质干扰都较少。但均质提取所消耗的时间最少，并且采用均质方式提取时，能够将样品均质完全，提取溶液完全渗入样品基质中，更加有利于提取溶剂在短时间内对基质样品中目标化合物的提取。因此，选择均质方法提取六种丁香酚类化合物。

表2 不同提取方法对六种丁香酚类化合物的提取效果的影响（n=5）Table 2 Effects of differentextractionmethods on the extraction effect of six kinds of eugenol compounds（n=5）

2.3 净化条件的选择

水产品种类繁多，并且成分复杂，采用单纯的提取液提取、浓缩后无法除去基质中大部分杂质的干扰。罗非鱼、鳗鲡均含有较高的脂肪，同时南美白对虾、梭子蟹肌肉中蛋白质的含量较高，并且含有脂溶性色素、有机酸以及脂肪酸等杂质，必须结合净化方法更好的去除样品中的杂质才能上机检测。样品净化前，采用冷冻离心的方式能够使部分蛋白质变性、脂肪冷凝沉淀而除去，但无法完全去除其他的杂质干扰。乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）含有伯胺和仲胺基团，对水产品中有机酸、糖类以及极性脂肪酸等均有良好的保留作用；C18能够较好的除去提取液中脂肪以及非极性碳水化合物［18-19］。因此，本实验研究了PSA和C18作为分散固相吸附剂吸附杂质，以对提取冷冻离心后溶液进行净化，将不同用量的PSA（25、50、75、100、150mg）和C18（50、75、100mg）分别加入到2m L混合标准溶液（5.0μg/m L）中，六种丁香酚类化合物的回收率见表3。

结果表明，三种杂质吸附剂对六种丁香酚类化合物的吸附均较小。随着PSA、C18含量的增加，丁香酚类化合物含量减少，说明其对杂质的吸附作用增加，致使丁香酚类化合物回收率偏低，降低了测量的准确性；但PSA、C18用量越大对样品中杂质的吸附作用也越好，因此选择PSA、C18含量均为75mg进行下一步实验。

石墨炭黑（GCB）能够有效的去除对虾及梭子蟹中脂溶性色素，使上机前溶液颜色变得澄清，排除杂质的干扰，因此研究了GCB用量为15、25mg时对提取效果的影响，结果见表3。当GCB用量为15mg和25mg时，净化后的溶液较澄清，几乎无色；而GCB用量为15mg时，对目标化合物的吸收相对较小，各目标化合物的回收率相对较高，因此选择GCB含量为15mg进行下一步的实验。

2.4 方法的线性范围和定量限

将标准储备液用混合溶剂（乙酸乙酯∶正己烷= 1∶1，v/v）分别逐级稀释，配制成0.05、0.10、0.25、0.50、1.0、5.0、10.0μg/m L的标准工作液，按照1.2.2中的色谱条件进行分析，以标准工作液浓度（x，μg/m L）为横坐标，以峰面积（y）为纵坐标作图，建立线性回归方程，结果表明：六种丁香酚类化合物在0.05～10.0μg/m L范围内，线性关系良好，相关系数在0.9995～0.9999之间。以10倍信噪比（S/N）计算定量限，该方法的定量限（LOQ）六种丁香酚类化合物均为0.1mg/kg。六种丁香酚类化合物的线性范围、线性方程、相关系数如表4所示。

图2 六种混合标准溶液色谱图（5.0μg/mL）Fig.2 The chromatogram of six kinds ofmixed mark solution（5.0μg/mL）

图3 空白对虾样品色谱图Fig.3 Chromatogram of Shrimp blank sample

图4 对虾样品加标色谱图（1.0mg/kg）Fig.4 Chromatogram of Shrimp spiked sample（1.0mg/kg）

表3 不同用量的PSA、C18和GCB对六种丁香酚类化合物的回收率影响Table 3 The recovery rate effects of six kinds of eugenol derivatives by different dosage of PSA、C18and GCB

表4 六种丁香酚类化合物的线性范围、线性方程、相关系数和定量限Table 4 The linear range，linear equations，correlation coefficient，quantification limitof six kinds of clove phenol compounds

六种丁香酚类化合物混合标准溶液色谱图、空白对虾和罗非鱼样品色谱图以及对虾和罗非鱼样品加标色谱图如图2～图6所示。

图5 空白罗非鱼样品色谱图Fig.5 Chromatogram of Tilapia blank sample

图6 罗非鱼样品加标色谱图（1.0mg/kg）Fig.6 Chromatogram of Tilapia spiked sample（1.0mg/kg）

2.5 方法的加标回收率和精密度

向空白罗非鱼、南美白对虾、鳗鲡以及梭子蟹肌肉样品中分别添加浓度为0.1、0.2、1.0mg/kg水平的混合标准溶液，每个浓度设5个平行，同时设一个空白对照，计算六种丁香酚类化合物的加标回收率及相对标准偏差（RSD），结果见表5。结果显示，六种丁香酚类化合物添加水平为0.1～1.0mg/kg时，其加标平均回收率为80.3%～103.2%，相对标准偏差为0.7%～5.4%，表明该方法的准确性和重现性好，符合残留分析要求。

表5 六种丁香酚类化合物加标回收率和相对标准偏差（n=5）Table 5 The standard addition recoveries and relative standard deviation of six kinds of clove phenol compounds（n=5）

3 结论

建立了一种同时检测水产品中六种丁香酚类麻醉剂（丁香酚、甲基丁香酚、异丁香酚、甲基异丁香酚、乙酸丁香酚酯、乙酰基异丁香酚）的分散固相萃取-气相色谱检测方法。样品经丙酮提取后浓缩，分散固相萃取剂进行净化，方法操作简单，处理后样品杂质干扰较少且基线平稳，方法的灵敏度和回收率都较高，重现性好，适合于批量水产品中丁香酚类麻醉剂的残留检测。此研究结果为水产品中丁香酚类化合物残留检测提供了有效的前处理方法和检测手段，因此，本研究对以后丁香酚类麻醉剂检测标准的制定具有有效的参考价值。

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Determination of six clove phenoldrug residues in aquatic products by gas chromatography with dispersive solid-phase extraction

CHEN Huan1，HUANG He1，*，GAO Ping2，YANG Jia-li2，HUANG Guo-fang2，LIUW en-xia2
（1.College of Food Science and Technology，Guangdong Ocean University，Guangdong Provincial Key Laboratory of Aquatic Product Processing and Safety，Key Laboratory of Advanced Processing of Aquatic Products of Guangdong Higher Education Institution，Zhanjiang 524088，China；2.National Marine Products Quality Supervision&Inspection Center（Zhanjiang），Zhanjiang 524094，China）

A dispersive solid-phase extraction-gas chromatography（GC）method had been developed for the detection of six kinds of eugenold rug residues in aquatic products at the same time.Sample was ultrasonic extracted by acetone，constant volume after rotary evaporation concentration，using dispersive solid-phase extraction（DSPE）purification，determined by gas chromatograph.External standard calibration was adopted in the determination.Six kinds of eugenol type of anesthetic showed good linearity in the concentrations range of 0.05～10.0μg/m L for the standard solutions carves，and all of the correlation coefficents（R2）were in 0.9995～0.9999.At the sp iked levels of 0.1～1.0mg/kg in tilap ia，south America white shrimp，eel，swimming crab muscle，the average recoveries were 80.3%～103.2%.The relative standard deviations were 0.7%～5.4%.The limits of quantificationg（LOQ），all of the six kinds of eugenol drug residues（Eugenol，Methyl eugenol，Iso-eugenol，Methyl iso-eugenol，Eugenolacetate，Acetyl iso-eugenol）were 0.1mg/kg.

gas chromatog raphy；dispersive solid-phase extraction（DSPE）；aquatic products；c love phenol；residual quantity

TS254.7

A

1002-0306（2015）08-0088-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.08.009

2014－07－15

陈焕（1988-），男，在读硕士研究生，主要从事食品质量与安全方面的研究。

*通讯作者：黄和（1962-），男，本科，教授，主要从事食品质量与安全方面的研究。

国家质检总局科技计划项目（2013QK272）。