小白菜与大白菜亚种间杂交减数分裂染色体行为观察

陈龙正，徐 海，宋 波，樊小雪

（江苏省农业科学院蔬菜研究所，江苏　南京　210014）

小白菜与大白菜亚种间杂交减数分裂染色体行为观察

陈龙正，徐 海，宋 波，樊小雪

（江苏省农业科学院蔬菜研究所，江苏南京210014）

研究了小白菜与大白菜亚种间杂交及回交世代花粉母细胞减数分裂行为，发现杂种F1花粉可染率90.7%，表现出较好的育性；回交BC1-3花粉可染率升高，表明育性逐步提高.F1花粉母细胞减数分裂正常染色体行为细胞数占总观察数的89.1%，这解释了F1具有较好育性的原因.杂种F1减数分裂各个时期会出现不正常现象，如双核仁、配对紊乱、染色体桥、染色体片段丢失等，这在一定程度上可以说明杂种F1育性低于正常二倍体的原因.14.3%的BC1花粉母细胞会出现不正常现象，而BC2-3已经相对正常，极少观察到减数分裂不正常现象，表明在回交过程中染色体稳定是一个快速的过程，这与表型及育性调查结果相吻合.

白菜；亚种间杂交；减数分裂；染色体行为

远缘杂交产生的F1代杂种包含了两个不同的染色体组，因而新形成的远缘杂种往往会受到“基因组冲击”（Genomic shock）：即两个不同的基因组进入到一个共同的核中，由于缺乏同源性，两个单倍性染色体组在减数分裂时不能正常配对，导致育性降低甚至高度不育［1-2］.然而，如果亲缘关系较近或者同源性较高的两个染色体组组合到同一细胞核中，由于同源染色体的存在，形成初期会发生联会正常，具有部分育性.

小白菜（Brassica campestris ssp.Chinensis Makino）又叫不结球白菜，属芸薹属白菜种不结球白菜亚种，与大白菜（Brassica camperstris ssp.pekinens）属同种不同亚种.已有的研究表明，小白菜与大白菜之间由于亲缘关系较近，不存在生殖隔离现象，杂交的亲和性较好［3-5］.但是，理论上两套不同的染色体组组合到同一细胞质中，由于非同源染色体的存在，导致减数分裂不正常［6］.尽管小白菜与大白菜亚种间杂交育性较好，在减数分裂过程中是否会出现染色体异常现象，是否存在修复机制却鲜有报道.本研究对小白菜与大白菜亚种间杂交F1进行减数分裂染色体行为进行观察，为探索两套染色体组合到同一胞质中修复机理奠定基础.

1　材料与方法

1.1材料

小白菜‘T青'由江苏省农业科学院蔬菜研究所提供.大白菜‘CCR13025'为抗根肿病高代自交系，由云南省农业科学院园艺研究所提供.通过亚种间杂交获得了杂种F1代，以‘T青'为轮回亲本进行回交并选择，获得抗根肿病BC3代［7］.对各世代进行群体取样，每个群体20～30株.

1.2方法

取0.5～2mm大小的幼小花蕾，用改良卡诺氏固定液（无水乙醇∶氯仿∶冰醋酸=5∶2∶3）固定24h，然后转到70%的酒精中放置于4℃冰箱中保存备用.参照钱春桃等［8］染色体制片方法进行制片，用卡宝品红染色.采用火焰微烤和45%醋酸分色制片.用OLYMPUS（BX-51）显微镜观察和拍照.

花粉生活力测定，是以在1%TTC溶液中可染色花粉的百分率统计.用SPSS（11.0）进行数据分析.

表1　不同世代花粉母细胞减数分裂正常比例Tab.1 Ratio of normal meiosis PMCs in different generations

2　结果与分析

2.1杂种及回交后代不同世代花粉育性调查

杂种F1花粉可染率达90.7%（表1），表现出较好的育性.回交BC1、BC2和BC3花粉可染率分别为92.4%、95.9%和96.4%（表1），呈逐步上升趋势，表明其育性逐步提高.对减数分裂花粉母细胞进行观察，每个世代随机抽取30～60个花粉母细胞进行统计结果发现，F1花粉母细胞减数分裂正常染色体行为细胞比例占总观察数的89.1%，只有8.9%的细胞表现不正常，这在一定程度上解释了F1具有较好育性. BC1减数分裂正常比例占85.7%，BC2和BC3分别是94.2%和93.8%（表1）两者差异不显著，但显著高于BC1，说明随着代数升高，减数分裂越来越正常，而且是一个快速的过程.

2.2杂种F1减数分裂异常现象

杂种F1在减数分裂除了正常染色体行为外，在各个时期少数花粉母细胞会出现不正常现象.在所有不正常减数分裂花粉母细胞中，主要表现为前期I出现双核仁现象，通常出现1个大核仁和1个小核仁（图1-A1-3）.极少数花粉母细胞会出现粗线期交叉结（图1-B1），终变期染色体配对紊乱（图1-B2），中前期形成四价体（图1-B3：2个四价体；图1-B4：1个四价体）.

在后期I纺锤丝牵引染色体分离出现减数分裂不同步现象（图1-C1-2），由于多价体的形成出现染色体桥（图1-D）和染色体片段的丢失（图1-E1-2）.试验中还观察到另一种减数分裂不同步现象即同一花蕾中，花粉母细胞减数分裂时期的不同步，有些花粉母细胞处于前期，而部分细胞已经到了中后期（图1-F），这些染色体异常行为，导致了亚种间杂种F1花粉母细胞发育出现不正常（图1-G），最终导致了亚种间杂种部分花粉败育.

2.3BC1-3减数分裂染色体行为观察

BC1在减数分裂除了正常染色体行为外，在各个时期少数花粉母细胞会出现不正常现象.在不正常减数分裂花粉母细胞中，主要表现为前期I出现双核仁、减数分裂不同步、染色体桥、染色体片段的丢失等.

BC2-3花粉母细胞减数分裂已经相当正常，极少观察到减数分裂不正常现象.在前期Ⅰ，细线期：染色体凝结成细丝状，附着在核仁一侧，形成了所谓的“花束”状染色体（图2-A）.粗线期：同源染色体完成配对，比细线期粗（图2-B）.双线期：染色体进一步收缩变粗，染色体明显比粗线期短（图2-C）.终变期：染色体更小与中期染色体大小基本相同（图2-D）.前期Ⅰ结束后，核仁解体.中期Ⅰ，染色体被纺锤丝牵引定位并紧密排列在赤道板上（图2-E）.后期Ⅰ同源染色体通过纺锤丝的牵引（图2-F），分别移向两极（图2-G）.末期Ⅰ同源染色体平均分配到两极（图2-H）.染色体开始解螺旋，但没有形成细胞板（图2-I），说明小白菜减数分裂为同时型胞质分裂.

图1　杂种F1减数分裂染色体异常行为观察Fig.1 Observation of abnormal meiotic behavior in F1hybrid

在两极的核仁解体和核膜消失之后，花粉母细胞进入第二次减数分裂.前期Ⅱ，两级再次出现清晰的染色体（图2-J）.中期Ⅱ，两组染色体由纺锤丝牵引在赤道板上（图2-K）.后期Ⅱ姊妹染色单体发生分离，随后被平均分配到四极（图2-L）.单分体染色体到达四极后即开始解螺旋，染色体消失（图2-M）.随后，经过细胞质分裂形成四分体（图2-N），最后发育成成熟的花粉粒（图2-O）.

3　讨论

远缘杂交是植物进化中的自然现象，是促进植物进化的主要动力之一，有利于拓宽遗传背景，促进外源优异基因的交流和利用.远缘杂交产生的杂种F1花粉粒育性与其亲缘关系远近有关，这主要取决于同源染色体配对难易程度［9］.本研究中，小白菜与大白菜同属芸薹属白菜种不同亚种，染色体数相同（2n=2x=20），亲缘关系相近，同源染色体较易配对，因此亚种间杂种F1花粉母细胞减数分裂相对正常，这在很大程度上可以解释尽管大白菜与小白菜在形态上差别较大，但它们之间杂交不存在生殖隔离情况的原因.但是，由于大白菜与小白菜染色体之间具有非同源性，因此在减数分裂中期Ⅰ出现了少量的非二价体形态的配对，后期出现染色体滞后、染色体桥、染色体片段丢失及染色体不同步分离等现象，导致其育性只有85.7%低于正常二倍体理论值100%.

通过回交转育，理论上在BC3代，轮回亲本（小白菜）核基因组占总基因组的15/16，BC3代的表型已经非常接近轮回亲本［7］.在细胞学上，回交高世代材料理论上应该更加趋向于二倍化的减数分裂.本研究发现，在回交3代后，减数分裂正常细胞数目由85.7%上升为94.2%，BC2与BC3已经没有显著性差异，表明在回交过程中染色体稳定是一个快速的过程，这与表型［7］及本研究育性（花粉可染率）调查结果相吻合.

在对以往远缘杂交的研究中发现，杂交后代主要通过DNA重排［10］、基因组同源序列的消除［11-13］、染色体组的重组［14］等机制，促进减数分裂中同源染色体的正确配对，从而产生遗传稳定的物种.本研究发现，在杂种F1及回交过程中出现了染色体片段的丢失等现象，一定程度上验证了以上假说.在表型观察中发现，在回交过程中，大白菜叶翼、叶片有毛、包心等现象逐渐丢失，这些重要表型性状的丢失与回交过程中染色体重组、片段丢失等变化之间的关系，目前尚不清楚，需要进一步研究.

图2　BC3花粉母细胞减数分裂过程Fig.2 Meiosis of pollen mother cells in BC3

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责任编辑：高 山

Chromosome Behaviors in Meiotic of Pollen Mother Cells in Inter-subspecific Hybridization between Chinese Cabbage and Non-heading Chinese Cabbage

CHEN Longzheng，XU Hai，SONG Bo，FAN Xiaoxue
（Vegetable Research Institute，Jiangsu Academy of Agricultural Sciences，Nanjing 210014，China）

Meiotic behaviors of pollen mother cells（PMCs）in inter-subspecific hybrid F1and BC1-3between Chinese cabbage and non-heading Chinese cabbage were studied.It was observed that 90.7%of F1pollen were stainable，indicating good fertility.The fertility of BC1-3was gradually increased.89.1%chromosome behavior in F1meiotic PMCs was regular which could explain the good fertility.Abnormal chromosome behaviors such as double nucleoli，disordered paring in Prophase I，chromosome bridge in metaphase I，segments loss in anaphase I were discovered which could explain the lower fertility of F1hybrid than normal diploid.14.3%abnormal chromosome behaviors were found in BC1generation however very limited in BC2-3which indicated that it was a repaid process for chromosome behavior of backcross generation becoming normal；this result was consistent to phenotype and fertility investigation.

Chinese cabbage；inter-subspecific hybrid；meiosis；chromosome behaviors

S634.3

A

1008-8423（2015）04-0421-04DOI：10.13501/j.cnki.42-1569/n.2015.12.017

2015-10-10.

江苏省自然科学基金项目（BK20130715）；农业部公益性行业（农业）科研专项经费项目（201403032）.

陈龙正（1980-），男，博士，副研究员，主要从事蔬菜遗传育种的研究.