河北省常栽平菇种质资源评价

李 慧，王朝江，杨红敏，高春燕

（河北省农林科学院遗传生理研究所，河北　石家庄　050051）

河北省常栽平菇种质资源评价

李 慧，王朝江，杨红敏，高春燕*

（河北省农林科学院遗传生理研究所，河北石家庄050051）

为了解河北省栽培平菇种质资源情况，同时发掘优异种质资源，更好的为平菇育种工作提供基础材料，本研究收集了河北省常栽的平菇品种共83株，通过拮抗试验对其“同物异名”菌株进行初步鉴定；基于ITS序列分析进行分类鉴定.并进一步对体细胞营养非亲和菌株的天然基质生长速率、抗霉力等部分生物学特性进行了测定分析.结果表明：河北省平菇栽培品种“同物异名”现象较为严重，经拮抗试验将83个平菇菌株划分为31个不同营养亲和群；经ITS序列比对分析，31个体细胞营养非亲和菌株中包括15株糙皮侧耳（Pleurotus ostreatus）、9株佛州侧耳（P.floridanus）、2株白黄侧耳（P.cornucopiae）、1株肺形侧耳（P.pulmonarius）及4株未界定种；经生物学特性分析筛选出了2株棉籽壳基质生长最适宜菌株和2株棉柴屑基质生长最适宜菌株，以及7个抗霉能力较强菌株，为后续的定向育种工作提供了优良材料.

平菇；种质资源；ITS；棉柴；抗霉力

平菇是我国栽培最为广泛的食用菌之一，也是河北省最主要的食用菌栽培品种［1］.实际生产中，糙皮侧耳、白黄侧耳、佛罗里达侧耳、肺形侧耳均统称为平菇［2］.近几年，随着食用菌产业的发展，传统品种出现菌种退化等现象［3］，栽培者对平菇新品种的需求越来越大，于是不同区域相互引种、老种新名导致了栽培品种菌种混杂、种源不清、同物异名严重、假冒伪劣菌种充斥市场，这严重制约了食用菌产业的发展.此外，随着传统栽培原料棉籽壳成本增加，新型栽培基质的研发显得尤有重要［4］.本研究，广泛收集河北省实际生产中栽培用的平菇品种，结合拮抗试验及ITS序列分析对平菇种质资源进行初步鉴别及物种分类，并考察了传统栽培基质（棉籽壳）和新型栽培基质（棉柴）上的菌丝生长速率及菌丝抗霉力两个重要育种材料筛选指标［5-6］，旨在解决河北省栽培平菇菌种名混乱现象，为实际生产的菌种流通提供数据参考，并为下一步的平菇育种工作提供基础数据支持.

1　材料和方法

1.1供试菌株

本研究以河北省常栽平菇品种的83个菌株为材料，来源于科研单位或菌种公司，其中1～24号菌株来自于河北省农林科学院，25～36号菌株来自于河北工程大学，37～47来自于中国农业科学院，48～71来自于石家庄市食用菌创新研究所（菌种公司），72～83来自于唐山市农科院.供试菌株编号及菌种名见表1.

表1　供试菌株Tab.1 The tested strains

1.2拮抗试验

1.2.1拮抗方法 首先将供试菌株接种于PDA培养基上活化，参考李何静［7］的方法，将活化菌种块接种于PDA培养基平板上，25℃倒置暗光培养，观察并记录两个接种块菌落交界处的拮抗反应.

1.2.2体细胞营养非亲和菌株的筛选 根据Korolev N［8］及郑素月［3］研究表明，同一营养亲和群内的菌株为同一菌株或来源相同且遗传关系很近的菌株.基于本研究为筛选育种材料的目的，宜选择亲缘关系差异大的材料，故本研究对于同一营养亲和群内菌株，随机选择一个菌株用于后续研究.

1.3体细胞营养非亲和菌株ITS序列分析

参考黄晨阳［9］的方法对体细胞营养非亲和性菌株进行ITS-PCR扩增，得到的PCR产物直接测序，对于未测序成功的，采用克隆后再测序.利用DNASTAR Lasergene 7.1中的SeqMan软件去除序列末端测序质量差或载体序列，并进一步拼接得到完整序列，利用NCBI中的Blast软件包对DNA序列进行比对分析，确认分子生物学物种.

1.4天然基质上的菌丝生长速率测定

天然基质选取传统栽培基质—棉籽壳及近几年河北省逐渐推广使用的新型基质—棉柴屑［5］为材料，以体细胞营养非亲和性菌株为研究对象.用打孔器取活化菌株菌落边缘生长旺盛的同龄菌种块，接种到装有灭菌天然基料的大试管中，置于25℃下暗光培养.每个测试菌株设3个重复，观察并测量天然基质上的菌丝生长速率.并采用SPSS 17.0软件对数据进行显著性差异分析.

1.5抗霉力测定

采用PDA平板对峙培养法.将活化的平菇菌丝打孔取相同大小的菌丝块接种到PDA平板的一边，25℃培养3 d后，再将同样大小的平菇木霉菌丝块接种到另一边共同培养，一段时间后，观察平菇菌丝与霉菌菌丝拮抗情况.如果平菇菌丝与木霉菌丝对峙生长，有明显拮抗线，则视为抗霉能力强.反之，如果平菇菌丝不能与木霉菌丝对峙生长，被木霉菌丝生长覆盖，则视为抗霉力弱.

图1　部分菌株的拮抗测定结果Fig.1 The results of antagonistic test for oyster mushroom strains

2　结果与分析

2.1体细胞营养亲和性测定结果

该试验测定了83个菌株两两之间的拮抗反应，部分菌株的拮抗反应见图1.根据菌丝交界处是否产生拮抗现象，将无拮抗反应的菌株划为同一营养亲和群，视为营养亲和菌株；有拮抗反应的菌株划为不同营养亲和群，视为营养非亲和菌株.83个供试菌株共划分为31个不同营养亲和群（表2）.其中有16个营养亲和群包含2个及以上菌株，推测这些菌株可能是“同物异名”.其中组6包含的菌株数最多为14个，次之为组10包含8株，组13包含7株.这三组中的双抗黑平、冀农11及原生2号均为河北省栽培最为广泛的平菇品种.从31个营养亲和群中随机选取一株组成营养非亲和性菌株群进行后续试验.

表2　拮抗试验结果Tab.2 The result of antagonism

2.2体细胞营养非亲和性菌株ITS序列分析结果

该试验的31个营养非亲和性菌株采用PCR产物直接测序未成功的有2个，经克隆后测序成功.利用NCBI中的Blast软件包对31个菌株的ITS拼接序列（含ITS1，5.8S rDNA和ITS2）与Genbank登陆的已知物种的ITS序列进行比对分析发现，各菌株的序列相似性指数从96%到100%不等.依据Hughes&Petersen［10］认为伞菌的ITS序列差异不超过2%～3%可定为同种的原则，31个菌株中有15株P.ostreatus（菌株编号为4、5、9、12、20、23、26、28、37、40、46、47、62、66、68）、9株P.floridanus（菌株编号为1、2、14、17、24、45、76、78、83）、2株P.cornucopiae（菌株编号为38和39）、1株P.pulmonarius（菌株编号68）.有4个菌株（菌株编号为7、13、34、66）的序列与Genbank登陆的P.ostreatus或P.floridanus比对相似性指数在97%以下，不能准确界定物种.但这也可能跟ITS-PCR扩增时出现碱基错配有关.

2.3天然基质上的菌丝生长速率测定

分别测定了31个营养非亲和性菌株在棉籽壳和棉柴屑上的菌丝生长速率，结果显示（表4和5），不同菌株分别在棉籽壳和棉柴屑两种不同天然基质上的菌丝生长速度差异较大，总体来讲菌丝在棉柴屑上的生长速率要远远快于棉籽壳，但同一菌株在两种基质上的生长速率差别较大，棉籽壳上生长最快的菌株为豫平5号和558，而棉柴屑上生长最快的菌株为中蔬10号及特早新丰.这可能与不同菌株分解不同基质相关酶系的活性不同有关.

表4　平菇菌株在棉籽壳上的菌丝生长速率比较Tab.4 The mycelial growth rateof oyster mushroom strains on cottonseed hull substrate

表5　平菇菌株在棉柴屑上的菌丝生长速率比较Tab.5 The mycelial growth rate of oyster mushroom strains oncotton stalk substrate

2.4抗霉力测定结果

采用平板对峙培养法评价了31个供试菌株的抗霉能力，如图2所示，A菌株表现为平菇菌丝与木霉菌丝对峙生长，两者形成比较明显的拮抗线，而B菌株表现为木霉菌丝可以覆盖平菇菌丝生长，不能形成拮抗线，认为A菌株的抗霉能力比B菌株强.结果显示，有7个平菇菌株抗霉能力较强，分别为双抗黑平、秦风黑平、2028、中蔬10号、灰美2号、CCEF99及CCEF89.有5个菌株抗霉能力较差，分别为高平88、小白平、2016、基因2005及夏抗50.

图2　部分菌株的抗霉力测定结果Fig.1 The results ofresistance to Trichoderma of oyster mushroom strains

3　讨论

平菇是河北省栽培最为广泛的食用菌品种之一，随着食用菌产业的迅速发展，传统品种老化退化，劳动力成本以及栽培原料价格不断上涨等因素都制约了平菇产业的发展，种菇者亟需高产、优质、抗病抗杂能力强、栽培基质适应范围广的优良新品种.但是，通过本研究发现，当下的平菇菌种市场“同物异名”现象仍较为严重，1个双抗黑平菌株竟有14个名字，实际生产中错种、假种的现象也时有发生，本研究以现有河北省广泛栽培的平菇菌种为材料，初步解决了平菇品种混乱的现象，可以为平菇生产提供种源清楚的菌株.

自从Gardes et al将ITS应用到真菌鉴定以来，以ITS序列分析为基础的真菌鉴定被广泛应用［11-12］.但黄晨阳等［9］研究认为ITS序列存在近缘种种内差异比种间大的问题，以及数据库序列信息的不准确性等因素造成了该方法的不准确.另外，金健康等［13］研究证明P.ostreatus、P.cornucopiae和P.floridanus为同一可交配群体，所以从生物学种的概念出发，P.ostreatus、P.cornucopiae和P.floridanus可以认为是同一个糙皮侧耳生物种群［14-15］.故本研究的31个河北省常栽平菇菌株除菌株基因2005为P.pulmonarius，其他菌株可认为是同一糙皮侧耳生物种群.

棉籽壳是食用菌代料栽培的主要原料，近几年，棉籽壳的价格逐渐上涨，然而由于棉籽脱绒技术的提高，棉籽壳营养含量却在下降，从而导致了食用菌生产成本升高、生物转化率降低的现象.科研人员因此研究了多种农业副产品作为食用菌新型栽培基质并取得了成功［16-17］.棉柴同样作为棉花副产品，其产量远远大于棉籽壳，近几年已成功被用于部分食用菌的生产中［5，18-20］.本研究初步评价了河北省常栽平菇菌株对棉柴基质的利用能力，为棉柴栽培平菇适宜菌株的筛选提供了数据支持.同时，认为对于食用菌新型基质的研发，除了对高产配方的研究外，还需要考虑对基质适应性强的菌株的选育.

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责任编辑：高 山

Evaluation on Germplasm of Oyster Mushroom Cultivated in Hebei Province

LI Hui，WANG Chaojiang，YANG Hongmin，GAO Chunyan*
（Institute of Genetics and Physiology of Hebei Academy of Agriculture and Forestry Sciences，Shijiazhuang 050051，China）

In order to evaluate the germplasm of oyster mushroom cultivated in Hebei province and find high-quality strains to be used as breeding samples，eighty-three oyster mushroom strains were collected. Antagonistic test of the 83 strains were employed to identify the same strain with different names.Internal Transcribe Spacer（ITS）of the tested strains were sequenced to identify the molecular species.Mycelial growth rate on two natural substrates and antibacterial action to Trichoderma of the vegetative incompatible strains was determined.The results showed that the 83 tested strains were divided into 31 vegetative compatibility groups including 15 strains of Pleurotus ostreatus，9 strains of P.floridanus，2 strains of P.cornucopiae，one strain of P.pulmonarius and 4 strains of uncertain species.Two strains were screened that were most suitable for growing on cottonseed hull and two strains on cotton stalk.Seven strains were showed excellent resistance to Trichoderma.These strains can be used as excellent samples for future breeding study.

Oyster mushroom；germplasm；ITS；cotton stalk；resistance to Trichoderma

S646.1+5

A

1008-8423（2015）04-0425-05DOI：10.13501/j.cnki.42-1569/n.2015.12.018

2015-10-12.

河北省农林科学院科技创新基本科研业务费项目（A2015110103）；国家现代农业产业技术体系建设专项资金（CARS-24）.

李慧（1986-），女，硕士，研究实习员，主要从事食用菌栽培与育种的研究；*

高春燕（1964-），女，副研究员，主要从事食用菌育种与栽培方面的研究.