多指标正交试验法优选滋阴明目片的提取工艺*

李卫平，邹龙，王连平，刘红宇

（1.岳阳职业技术学院，湖南岳阳414000；2.湖南中医药大学，湖南长沙410208；3.湖南中医药大学第一附属医院，湖南长沙410208）

多指标正交试验法优选滋阴明目片的提取工艺*

李卫平1，邹龙2，王连平2，刘红宇3

（1.岳阳职业技术学院，湖南岳阳414000；2.湖南中医药大学，湖南长沙410208；3.湖南中医药大学第一附属医院，湖南长沙410208）

目的优选滋阴明目片的提取工艺。方法以马钱苷、丹酚酸B的含量及浸膏得率为综合评价指标，采用L9（34）正交试验设计，考察加水量、提取时间、提取次数3个因素对提取工艺的影响。结果最佳提取工艺为加（10，10，10）倍量水，提取3次，每次提取时间为90min。结论优选的水提取工艺稳定、可行。

正交试验法；滋阴明目片；提取工艺

滋阴明目丸由黄精、山茱萸、熟地、牡丹皮、丹参、淮山、菟丝子、牛膝、当归、石决明、三七、枸杞、茯苓、羌活、川芎、石菖蒲、楮实子17味中药组方，具有滋阴、活血、利水的功效，对原发性视网膜色素变性、视神经萎缩、黄斑变性等难治性眼疾疗效显著。拟将滋阴明目丸剂型改为片剂，以更好地适应患者需求［1-3］。现采用正交试验设计法，以马钱苷、丹酚酸B的含量和浸膏得率为考察指标优选提取工艺，为片剂标准化生产提供试验依据。

1　仪器与试药

FE102型微型植物粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）；DHG101型电热恒温鼓风干燥箱（巩义市英峪予华仪器厂）；TP214型分析天平（南京庚辰科学仪器有限公司）；Agilent1100型高效液相色谱系统（安捷伦科技有限公司）；AR2140型电子天平（奥豪斯仪器上海有限公司）。丹酚酸B对照品（中国药品生物制品检定所，批号为MUST-12020104，纯度≥98%）；马钱苷对照品（中国药品生物制品检定所，批号为111640-200604，纯度≥98%）；乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯，水为重蒸水。山茱萸、黄精等17味药材均购于长沙医药公司，由湖南中医药大学邹龙教授鉴定，符合2010年版《中国药典（一部）》规定。

2　方法与结果

2.1丹酚酸B与马钱苷含量测定［4-7］

2.1.1色谱条件与系统适用性试验

丹酚酸B：色谱柱为KromasilODS柱（250mm×4.6mm，5μm）；流动相为甲醇-乙腈-1.67%甲酸水（24∶10∶66）；检测波长为286 nm；流速为1.0mL/min。理论板数按丹酚酸B峰计算应不低于2 000。在此色谱条件下的色谱图见图1。

图1　丹酚酸高效液相色谱图

马钱苷：色谱柱为KromasilODS柱（250mm×4.6mm，5μm）；流动相为水-乙腈（90∶10）；柱温为25℃；流速为1.0mL/min；进样量为10μL。理论板数按马钱苷峰计算应不低于3 000。在此色谱条件下的色谱图见图2。

2.1.2溶液制备

图2　马钱苷高效液相色谱图

分别精密称取干燥至恒重的对照品丹酚酸B 0.006 0 g和马钱苷0.004 2 g，置50 mL容量瓶中，加80%甲醇溶解、定容，分别制得0.12 g/L的丹酚酸B对照品溶液和0.084 g/L的马钱苷对照品溶液［8］。称取浸膏粉适量，置具塞锥形瓶中，加入80%甲醇50mL，称重，超声溶解后再次称重，用80%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液即为供试品溶液。分别取缺丹参的其余药味、缺山茱萸的其余药味，按正交试验的优化工艺分别制成缺丹参和缺山茱萸的阴性样品，按对照品溶液制备方法制备阴性对照品溶液［9］。

2.1.3方法学考察

阴性干扰试验：取缺丹参的阴性对照品溶液，按拟订色谱条件进样测定。结果供试品溶液在丹酚酸B对应色谱峰（主峰保留时间为11.73min）处无相应峰出现，表明方中其他药味对丹酚酸B的测定无干扰。取缺山茱萸的阴性对照品溶液，按拟订色谱条件进样测定。结果供试品溶液在马钱苷对应色谱峰（主峰保留时间为19.74min）处无相应峰出现，表明方中其他药味对马钱苷的测定无干扰。

线性关系考察：精密吸取丹酚酸B对照品溶液，分别进样2.0，4.0，6.0，8.0，10.0μL，测定峰面积，以峰面积（Y）对进样量（X）进行线性回归，得回归方程Y=1 035.6 X-20.733，r=0.999 9（n=5）。结果表明，丹酚酸B进样量在0.24～1.20μg范围内与峰面积线性关系良好。精密吸取0.084g/L马钱苷对照品溶液4，6，8，10，20μL，注入液相色谱仪，测定峰面积。以峰面积（Y）对进样量（X）进行线性回归，得回归方程Y=2 117.5X-10.638，r=0.999 5（n=5）。结果表明，马钱苷进样量在0.336～1.68μg范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：精密吸取同一对照品溶液，重复进样6次。结果的RSD为1.68%（n=6），表明仪器精密度良好。

重复性试验：精密称取批号为20121022的样品，平行制备6份供试品溶液，分别进样测定。结果丹酚酸B含量的RSD为1.56%（n=6），马钱苷含量的RSD为1.66%（n=6），表明该方法重复性良好。

加样回收试验：精密称取批号为20121022的样品6份，加入丹酚酸B对照品适量，依法测定并计算回收率。结果平均回收率为98.90%，RSD为1.16%（n=6）；精密称取批号为20120922样品6份，加入马钱苷对照品适量，依法测定并计算回收率。结果平均回收率为99.55%，RSD为0.71%（n=6）。

稳定性试验：精密吸取同一供试品溶液，分别于0，1，3，6，12 h时进样测定。结果丹酚酸B、马钱苷峰面积的RSD分别为1.88%和1.46%（n=5），表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.2浸膏得率测定

按处方比例称取药材9份，每份17味药材，单剂合计135 g，用水回流提取，合并提取液，离心抽滤，浓缩，85%乙醇醇沉，过滤，浓缩干燥，在65℃真空干燥箱中干燥，称重，计算浸膏得率。2.3正交试验设计

经预试验摸索得知，加水量、提取时间、提取次数对产品收率影响大，选取加水量（因素A）、提取时间（因素B）、提取次数（因素C）为考察因素，每个因素设计3个水平，采用L9（34）正交表对工艺进行考察。因素水平表见表1。

根据组方药材有效部位（成分）主要以水溶性为主，故将方中药材用水回流提取，醇沉，浓缩干燥成浸膏，测定浸膏中丹酚酸B、马钱苷的含量，采用加权综合评分法优选最佳提取工艺［10-11］。

从100mL提取液中精密移取适量，过0.45μm微孔滤膜，置入高效液相色谱系统，依法测定，记录峰面积，测定丹酚酸B和马钱苷的含量，并计算丹酚酸B和马钱苷的提取率，结果见表2。对加权分析的结果采用SPSS 16.0软件进行方差分析，结果见表3。

由表2可见，R值反映加水量、提取时间、提取次数3因素的主次位置为C＞B＞A，即提取次数＞提取时间＞加水量。表3中的加权结果显示，PC＜0.05，PA，PB＞0.05，只有提取次数（C）有统计学意义。根据表2中浸膏得率、丹酚酸B提取率、马钱苷提取率及综合评分4项指标的K值大小，得知A2B3C3为最佳工艺条件，即加10倍量水、提取3次、每次90min。

2.4验证试验

按处方比例称取药材3份，以A2B3C3为条件，平行试验3次，分别测定浸膏得率、丹酚酸B和马钱苷提取率，加权统计结果见表4。结果表明，浸膏得率、丹酚酸B提取率、马钱苷提取率3次试验结果稳定且综合评分较高，与正交试验结果一致，正交优选的工艺条件稳定。

表1　因素水平表

3　讨论

滋阴明目丸使用已达20余年，针对视神经萎缩、黄斑变性等多种难治目疾疗效确切，安全可靠，值得深入研究。本试验运用多指标正交设计法，采用2010年版《中国药典（一部）》马钱苷、丹酚酸B的含量测定方法优选滋阴明目片的提取工艺。结果表明，该方法简便快速，基线基本分离，杂质对标准品峰无干扰，可作为滋阴明目片提取工艺质量控制的指标。试验优选的最佳工艺条件为，加10倍量水，每次90min，提取3次。

表2　L9（34）正交试验设计与结果（n=3）

表3　加权综合分数方差分析表

表4　验证试验结果

［1］庞惠萍，李起家，干性年龄相关性黄斑变性的治疗时机探讨［J］.中国保健营养，2012，26（10）：127.

［2］刘志恒，炎症与年龄相关性黄斑变性［J］.临床眼科杂志，2012，20（3）：182.

［3］李波，张波涛，李传课，等，滋阴明目丸治疗湿性老年性黄斑变性的临床观察［J］.中国中医眼科杂志，2007，17（6）：311-312.

［4］杨小宁，唐星，柳玉石，等.丹参中总酚酸的分离纯化工艺研究［J］.中草药，2007，38（6）：843-846.

［5］谢静，丹参水溶性成分提取工艺研究［J］.中国药业，2009，18（3）：27-28.

［6］梁晋如，何姣，朱砂，等.山茱萸中莫诺苷和马钱苷的药理作用及提取分离方法研究进展［J］.中国药理通讯，2011，29（4）：29.

［7］张燕，宋鹏飞.HPLC法测定清眩糖浆中马钱苷的含量［J］.解放军药学学报，2012，28（4）：353-354.

［8］朱砂，梁晋如，何姣，等.HPLC法同时测定不同产地及不同采收时间山茱萸中三个环烯醚萜苷的含量［J］.药物分析杂志，2012，32（7）：1 235-1 238.

［9］国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）［M］.北京：中国医药科技出版社，2010：26.

［10］郝延军，赵晓笠，桑育黎，等，六味地黄丸对照提取液的实验研究［J］.中草药，2013，44（2）：180-182.

［11］贺娟妮，刘晓，牟朝丽，等.山茱萸中3种环烯醚萜苷的响应曲面优化微波提取及HPLC测定［J］.中药材，2011，34（7）：1 118-1 122.

Optim ization of Ziyinm ingmu Tablets Extraction Process by M ulti-Index Orthogonal Experiment

Li Weiping1，Zou Long2，Wang Lianping2，Liu Hongyu3
（1.Yueyang Vocational Technical College，Yueyang，Hunan，China 414000；2.Hunan University of Chinese medicine，Changsha，Hunan，
China 410208；3.First Hospital of Hunan University of Chinese medicine，Changsha，Hunan，China 410208）

Objective To optimize the extract process of Ziyinmingmu Tablets.M ethod With the content and extraction rate of the loganin and salvianolic acid B as the comprehensive evaluation index，The orthogonal test of L9（34）was adopted to inspect the influence of volume of water，extract time and extract frequency on the extraction process.Result The best extraction process was adding（10，10，10）times amount water，and extracting 3 times with 90 minutes each time.Conclusion The optimal extraction process is stable and feasible.

orthogonal experiment；Ziyinmingmu Tablets；extraction process

TQ461；R284.1；R286.0

A

1006-4931（2015）16-0016-04

李卫平（1975-），女，硕士研究生，副教授，研究方向为中药新制剂工艺与质量标准，（电子信箱）1307878066@ qq.com；刘红宇，硕士研究生，副主任药师，研究方向为中药新制剂工艺与质量标准，本文通讯作者，（电子信箱）lhy9544@ 163.com。

2014-05-28；

2014-11-12）

*湖南省中医药管理局科研计划项目，项目编号：201124。