鄱阳湖湖区主要微生物生理群数量与环境因子关系研究

2015-10-22张志红于一尊黄江丽张国华谭胤静郑国华涂祖新陈宇炜

生态环境学报 2015年6期

张志红，于一尊，黄江丽，张国华，谭胤静，郑国华，涂祖新，陈宇炜

1.江西省科学院生物资源研究所，江西南昌 330096；2.江西省科学院微生物研究所，江西南昌 330096；3.中国科学院南京地理与湖泊研究所，江苏南京 210008

随着社会和经济的发展，人类活动导致湖泊污染己成为严重的环境问题，其中湖泊富营养化是最主要表现（王国惠，1998）。据报道，我国有63.3%的湖泊已经达到富营养化水平，氮、磷是公认的重要影响因子。在湖泊生态系统中，氨化细菌（Ammonifying bacteria）将水中的有机氮转化为无机氮，其中大部分转化为气态的氨气直接进入大气，反硝化细菌（Denitrifying bacteria）将无机氮盐（NO3--N及NO2--N）还原为N2O及N2，释放到大气中，降低了水体中的氮负荷，对于富营养化湖泊的净化具有重要意义（GILLIAM，1994）。大肠杆菌（Escherichia coli）是评价水质好坏的一个重要卫生指标，是反映水体被生活污水污染重要的监测项目。

鄱阳湖是我国最大的淡水湖，拥有丰富的水资源和生物资源，具有蓄洪、航运、灌溉、水产养殖和旅游等多方面功能。鄱阳湖区社会经济与环境保护相互协调、共同发展，是湖区发展战略的重要内容，水环境保护则是鄱阳湖区环境保护的基本内容和主要目标。近年来，环鄱阳湖地区大规模发展渔业养殖，围湖区域水产养殖面积超过 18.67×104hm2，水产养殖总产量达 5.8×104t，水产养殖业迅猛发展加速了湖泊水体的富营养化。另外，农村面源污染也十分严重，2012年时，全流域化肥施肥量4.27×107t，农药施用量为1×106t，大量未被利用的化肥和农药残留物直接或者间接进入鄱阳湖水体，导致鄱阳湖水质下降（王圣瑞等，2013）。鄱阳湖污染物来源以及污染变化与洞庭湖有许多相似之处，但是鄱阳湖也有自己独特性（李有志等，2011）。鄱阳湖是一个季节性涨水湖泊，具有“高水是湖，低水似河”独特的自然地理景观。每年汛期，五河洪水入湖，湖水漫滩，洪水一片；冬春季节，湖水落槽，滩地显露，水面缩小，洪、枯水位面积相差10多倍，水量变化也将对湖区微生物生理群和环境因子产生巨大影响。本文以氮循环微生物和大肠杆菌群等生理菌群为研究对象，分析这些菌群时空分布特征以及与氮、磷等富营养化指标的相关关系，以期为环境监测和保护鄱阳湖水质提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集

样品采集时间选择鄱阳湖丰水期和枯水期两个时间段，丰水期采样时间为2012年7月份，枯水期采样时间为2013年1月份，样品采集点分布见图 1。水样基础数据由中国科学院鄱阳湖湖泊湿地观测研究站提供。

1.2 培养基

蛋白胨培养基（检测氨化细菌）：蛋白胨5.0 g，磷酸氢二钾0.5 g，磷酸二氢钾0.5 g，硫酸镁0.5 g，蒸馏水1000 mL，pH=7.2。

改良斯蒂芬逊培养基 A（检测亚硝化细菌）：硫酸铵2.0 g，磷酸氢二钾0.75 g，磷酸二氢钠0.25 g，硫酸锰0.01 g，硫酸镁0.03 g，碳酸钙5.0 g，蒸馏水1000 mL，pH=7.2。

改良斯蒂芬逊培养基B（检测硝化细菌）：亚硝酸钠1.0g，磷酸氢二钾0.75 g，磷酸二氢钠0.25 g，硫酸锰0.01 g，硫酸镁0.03 g，碳酸钠1.0 g，碳酸钙1.0 g，蒸馏水1000 mL，pH=7.2。

反硝化细菌培养基：硝酸钾2.0 g，硫酸镁0.2 g，磷酸氢二钾1.0 g，磷酸二氢钾1.0 g，柠檬酸钠5.0 g，蒸馏水1000 mL，pH=7.2。

乳糖胆盐发酵培养基（检测大肠杆菌）：蛋白胨0 g，猪胆盐5.0 g，乳糖10 g，溴甲酚紫0.01 g，pH（7.4±0.2）。

牛肉膏蛋白胨培养基（检测异养细菌）：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10 g，琼脂15～20 g，蒸馏水1000 mL，pH 7.0～7.5。

解磷细菌培养基：葡萄糖10 g，硫酸铵0.5 g，氯化钠0.3 g，氯化钾0.3 g，硫酸镁0.3 g，硫酸亚铁0.03 g，硫酸锰0.03 g，碳酸钙5.0 g，卵磷脂0.5 g，磷酸三钙2.0 g，琼脂15～20 g，蒸馏水1000 mL，pH 7.0～7.5。

1.3 试验方法

大肠杆菌、氮循环微生物（氨化细菌、亚硝化细菌、硝化细菌和反硝化细菌）采用 MPN方法，大肠杆菌测定1、10、100 mL 3个浓度水平，氨化细菌、亚硝化细菌、硝化细菌测定0.1、1、10 mL 3个浓度水平，每个浓度重复3次，五种生理菌群阳性检测和观察参考相关文献（陈绍铭和郑福寿，1985）。

异养细菌和解磷细菌计数采用稀释平板涂布法，水样连续稀释100倍后取0.1 mL涂平板；底泥样品称取10 g，加入装有90 mL无菌水锥形瓶中，充分震荡5 min稍静置后取上清液连续稀释100倍取0.1 mL涂平板。

1.4 数据分析

所有试验数据用Excel 2003和SASV 8.0统计软件分析。

2 结果与讨论

2.1 丰水期水体中主要生理菌群数量和分布

2012年7 月份鄱阳湖丰水期水样结果见表1。大肠杆菌平均数量为109.82 MPN·100mL-1，其中有33个样品中大肠杆菌小于20 MPN·100 mL-1，达到国家一类水标准，占总样品数44.0%。水质最差、大肠杆菌为300 MPN·100mL-1有23个，占总样品数30.67%，具体分析这些采样点分布区域，多是距离居民生活区较近，与人类生活、渔业和畜禽养殖等密切相关。测定氮循环微生物，硝化细菌数量最高，所有样品在检测浓度内全部变色，数量超过3000 MPN·100mL-1。氨化细菌平均为 975.11 MPN·100mL-1，亚硝化细菌（Nitrosobacteria）和反硝化细菌数量相对较低，平均为 45.68和 127.51 MPN·100 mL-1。不同湖泊流域中氮循环生理菌群数量不同，闫韫（2008）研究布吉河发现氨化菌数量最多，高达 8～12个数量级，亚硝化细菌和硝化细菌数量极少，认为氮循环菌群存在严重的数量不均衡现象。综合分析不同采样点氮循环菌群和大肠杆菌数量，再结合总氮、总磷测定结果，认为都昌周溪镇、西源乡、梦溪乡狮山乡等一带水域以及鄱阳湖湖区中心是微生物数量最少的区域，同时氮、磷等也较低，水质好，属于轻度富营养化；五河入湖口以及临近居民生活区域的采样点，微生物数量和氮、磷含量最高，出现不同程度的富营养化。鄱阳湖营养盐浓度较高，2009─2011年年均总氮浓度为1.719 mg·L-1，总磷浓度为 0.090 mg·L-1，且有逐年增加的趋势，按照营养状态划分标准，鄱阳湖某些区域处于明显富营养化状态（WU等，2013）。分析水体中异养细菌，平均数值为 149.48×103CFU·mL-1，样品之间差异较大。测定水体中解磷细菌和有机磷农药降解菌，少数样品数量在20～80·mL-1，多数样品中没有检测到解磷细菌，水体中也没有富集到降解甲胺磷等农药的微生物。观察分离所得异养细菌，发现水体中以革兰氏阴性为主，产色素菌数量较高，占总异养细菌数量10%左右。初步鉴定，细菌中假单胞菌（Pseudomonas）较多，其次为芽孢杆菌（Bacillus）和肠杆菌（Enterobacteriaceae），还有微球菌属（Micrococcus）、色杆菌属（Chromobacterium）、黄杆菌属（Flavobacterium）和黄单孢菌属（Xanthomonas）等细菌，分析结果与多数湖泊异养细菌类型相似（吴根福等，1999）。

表1 丰水期部分取样点水体中五种生理菌群和异养细菌数量Table 1 Amount of different bacteria in Poyang lake during wet seasons

2.2 丰水期水体中主要生理菌群和水质关系

将鄱阳湖水质基础数据与大肠杆菌和氮循环微生物进行相关性分析，结果表明（见表 2），溶氧量（DO）与亚硝化细菌成极显著正相关，与亚硝化细菌是好氧菌有关。电导率与氨化细菌成极显著正相关，而与亚硝化细菌则成显著负相关，可能这两种菌群与某类物质增加或减少密切有关。总氮含量（TN）与样品中大肠杆菌、氨化细菌和亚硝化细菌均成极显著正相关，总氮含量高，引起大量氮循环微生物繁殖，利于污染物降解。亚硝酸盐（NO2-）、硝酸盐（NO3-）和铵盐（NH4+）含量与氮循环微生物没有显著性相关关系，此结果在一定程度上表明，水体中氮循环微生物数量高低与氮总量有关，是不同氮的综合效应。吴楚等（2000）研究九山湖表明，硝化细菌与铵盐存在显著的正相关、反硝化细菌与亚硝酸盐存在显著正相关，王国惠（1996）认为湖区中铵盐（NH4+）数量与亚硝化细菌不存在相关性有3个原因：（1）藻类与亚硝化细菌对氨氮竞争；（2）硝化细菌和亚硝化细菌属于自养菌，过多的有机质会阻碍它们的发育；（3）氨氮的瞬时浓度可能较高，当取样次数有限时，存在误差，而吴根福等（1999）研究表明自养型细菌（如硝化细菌）在水质较好的水体中分布广泛，异养型微生物如氨化细菌等在富营养化严重的湖中密度较大。分析还发现大肠杆菌与氨化细菌、亚硝化细菌和反硝化细菌均呈极显著正相关（相关系数R分别为0.518、0.442和0.332，结果略）。不同生理菌群数量高低，除了与氮、磷等含量有关，温度、pH、水流速度等也是不可忽视的影响因素。

表2 鄱阳湖丰水期各指标之间的相关性分析Table 2 Correlation analysis of different indexes in Poyang lake during wet seasons

表3 部分鄱阳湖底泥样品中不同微生物数量Table 3 Amount of different bacteria in Poyang lake sediments

2.3 丰水期湖区底泥中细菌数量和分布

比较底泥中异养细菌、芽孢杆菌和解磷细菌（Phosphate-solubilizing bacteria）数量（见表3），芽孢杆菌占全部异养细菌总量的30%左右，解磷细菌数量低，仅占 5%左右。不同解磷细菌解磷效果差异较大，有些解磷细菌初次筛选效果明显，解磷圈与菌落之比达到3.5以上，纯化后多数解磷细菌的解磷圈消失，说明解磷效果容易受外界影响。将3类细菌与水体中总氮、总磷和磷酸盐（PO43-）进行相关性统计分析（见表 4），底泥中的芽孢杆菌与异养细菌之间呈极显著正相关关系，解磷细菌和水体中总氮和总磷之间呈显著负相关关系，而与磷酸盐之间却呈极显著正相关关系，这个结果是否表明底泥中的解磷细菌通过降解作用释放出更多内源磷，从而提高了水体中磷酸盐数量？苏争光等（2014）在研究分析云南抚仙湖内源磷来源时提出沉积物中解磷细菌数量决定抚仙湖沉积物磷释放强度。

表4 丰水期底泥中微生物与水体中总氮、总磷和磷酸盐相关性分析Table 4 Correlation analysis of total P, N, PO43- and bacteria in Poyang lake sediments

表5 鄱阳湖丰水期和枯水期水体中四种生理菌群数量的比较Table 5 Compare of bacteria amounts in Poyang lake between wet and dry seasons

2.4 枯水期和丰水期主要生理菌群数量比较

比较丰水期和枯水期微生物差异（见表5），大肠杆菌、氨化细菌、亚硝化细菌数量变化一致，7月份丰水期取样明显高于冬季枯水期，分别比冬季高出21.5、21.4和11.5倍。一方面随着夏季的到来，不同有机物随雨水进入湖泊，为微生物的生长和繁殖提供丰富的底物；另一方面夏季温度升高，加速了微生物的繁衍，从而增加了微生物的生物量（WU等，2014）。说明温度是影响大肠杆菌、氨化细菌和亚硝化细菌数量和分布的主要因素。吴根福等（1999）研究杭州西湖水体中氨化细菌在夏季较少，冬季反而较多。反硝化细菌具有还原硝酸盐成亚硝酸盐并进一步还原生成氮气作用，解除亚硝酸盐的危害，反硝化细菌数量对于降低鄱阳湖富营养化问题具有重要意义。本研究中反硝化细菌变化同其它3类微生物相反，冬季反比夏季高出 5.3倍。分析原因有两个可能：（1）鄱阳湖水体中浮游植物的光合作用对于反硝化细菌生长具有抑制作用，而夏季正值鄱阳湖水体中浮游植物生长的旺盛期（WU等，2014），通过光合作用产生大量的氧，不利于反硝化细菌的生长。冬季枯水期随着浮游植物的大量衰亡，湖中氧气的减少，反硝化细菌的数量则呈升高的趋势；（2）当鄱阳湖处于枯水期，硝酸盐浓度相对提高，刺激了反硝化细菌大量繁殖。研究结果同白雪等（2012）分析黑龙江省北部五大连池反硝化细菌与温度变化关系一致。王国惠（1996）研究认为反硝化细菌与温度和藻类数量呈显著的正相关，由于温度很高时，异养菌大量繁殖致使有机物得以降解，无机物大量释放，致使藻类浓度升高，但环境中氧的浓度也大幅度下降，有利于反硝化细菌的繁殖。硝化作用发生在好氧条件下，反硝化作用发生在厌氧或兼性厌氧环境，随着研究的不断深入，多种好氧反硝化微生物陆续从不同环境中筛选出来（杨小龙等，2011；韩永和等，2013）。出现不同研究结果，需要进一步分析氮循环相关微生物自身功能的多样性，以及湖泊水域环境条件，如水生植物覆盖对氮循环微生物影响最大（王国祥等，1998）。

3 结论

丰水期样品中5种生理菌群数量差异较大，四种参与氮循环的微生物中，硝化细菌数量最高，氨化细菌、亚硝化细菌和反硝化细菌数量相对较低；有 44%水样品中大肠杆菌数量低于 20 MPN·100mL-1，达到国家一级水标准，鄱阳湖水质总体保持良好。多数水样品中没有检测到解磷细菌，底泥中存在大量解磷细菌，占异养细菌 5%左右。比较丰水期和枯水期样品，大肠杆菌、氨化细菌和亚硝化细菌3种菌群由于温度原因，冬季枯水期明显低于夏季丰水期，反硝化细菌枯水期明显高于丰水期，温度和溶解氧是重要影响因素。总氮与样品中大肠杆菌、氨化细菌和亚硝化细菌均呈现极显著正相关关系，大肠杆菌与氨化细菌、亚硝化细菌和反硝化细菌也呈现极显著正相关关系。大肠杆菌、氨化细菌和亚硝化细菌可以作为鄱阳湖夏季总氮污染的主要指标微生物。

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