双菌发酵黄浆水制备豆腐凝固剂培养条件优化

吕　博，黎晨晨，刘　宁，李　健（哈尔滨商业大学食品工程学院，黑龙江省高校食品科学与工程重点实验室，黑龙江哈尔滨150076）

双菌发酵黄浆水制备豆腐凝固剂培养条件优化

吕博，黎晨晨，刘宁，李健*
（哈尔滨商业大学食品工程学院，黑龙江省高校食品科学与工程重点实验室，黑龙江哈尔滨150076）

以豆腐黄浆水为原料，经保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌发酵制备豆腐凝固剂。研究了黄浆水初始pH、乳糖添加量、发酵时间、培养温度、接种量等因素对乳酸菌产酸量的影响，在此基础上采用正交实验优化培养基碳源及发酵条件。实验结果表明最佳的凝固剂培养条件为：黄浆水中乳糖添加量1.5%、黄浆水初始pH=6.5、接种量6%、培养温度37℃、发酵时间84h的条件下乳酸量为5.1g/L。在此工艺条件下豆腐出品率为196.43%，硬度为419.15g，黏聚性为261.42gs，蛋白质含量9.62%。与其他方法相比，方法具有提高凝固剂中乳酸含量，改善豆腐凝固剂功能性，同时提高了豆腐中蛋白质含量。

豆腐黄浆水，保加利亚乳杆菌，嗜热链球菌，有机酸凝固剂，发酵

豆腐黄浆水是豆腐生产过程中的副产物之一［1-2］，其中含有蛋白质、糖，大豆异黄酮，钾、钠，维生素等多种营养成分［3-4］，随着豆腐行业的发展，黄浆水作为其副产物，其处理问题日益受到关注［5-6］。

豆腐凝固剂是豆腐制作过程中的重要添加剂之一［7］。有机酸类豆腐凝固剂是以降低豆浆溶液的pH使其接近蛋白质的等电点的方法，达到沉降蛋白质的目的。酸浆作为豆腐凝固剂有着悠久的历史，由于酸浆需自然发酵后才可作为凝固剂点豆腐，并且浆循环使用，存在潜在的安全卫生问题。宋莲军等［8］将乳酸、乙酸等有机酸按照一定比例混合制成复合豆腐凝固剂，弥补了单一凝固剂制得豆腐在弹性、硬度方面的不足，但是口味稍酸，风味欠佳。乔明武等［9］用响应曲面法优化发酵条件制备凝固剂，发酵时间短，但接种量和乳糖添加量较大。王璐等［10］利用山楂、五味子、灯笼果等药食两用食品，通过超声辅助水浴法提取总酸，制得天然新型豆腐凝固剂，消除了化学合成酸性凝固剂对人体的不利影响，但制成的豆腐不硬挺。

常用的豆腐凝固剂为石膏、盐卤、葡萄糖-δ-内脂。利用微生物发酵制备豆腐凝固剂的研究还不是非常全面。保加利亚乳杆菌（Str.Thermophilic）和嗜热链球菌（Lb.Bulgaricus）存在共生关系，两者混合发酵能提高产酸速度，减弱后酸化程度，促进风味物质产生，并能调节人体肠道菌群［11-13］。因此本实验以豆腐黄浆水为原料，采用正交实验优化方法探讨保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌共同发酵制备新型的有机酸豆腐凝固剂，以期提高黄浆水中乳酸含量并赋予其特有的乳香味，减少处理副产物的工序和成本，提高资源利用率，为新型豆腐凝固剂的研制提供基础数据。

1　材料与方法

1.1材料与设备

乳酸菌哈尔滨商业大学食品学院农产品实验室提供；黄浆水李氏豆腐坊；NaOH（分析纯） 天津市大陆化学试剂厂；酚酞天津市天新精细化工开发中心；乳糖（食品级） 武汉万荣科技发展有限公司；葡萄糖（分析纯） 天津市致远化学试剂有限公司；DNS（3，5-二硝基水杨酸）（分析纯） 北京笃信精细制剂厂；盐酸（分析纯） 丹东市龙海试剂厂；柠檬酸（食品级） 济南历下雅轩化工产品经营部；硫酸铜（分析纯）天津市劢特吉尔环保技术研究所；硫酸钾（分析纯） 天津市天力化学试剂有限公司；碳酸钠（食品级） 天津市鑫大宇化工有限公司。

DHP-9032型电热恒温培养箱、DHG-9123A型电热恒温鼓风干燥箱上海一恒科学仪器有限公司；LDZX-30KBS型立式压力蒸汽灭菌器上海申安医疗器械厂；SW-CJ-1FD型单人单面净化工作台苏州净化设备有限公司；721E型可见分光光度计上海光谱仪器有限公司；pHS-25数显pH计上海精密科学仪器有限公司；ALC-110.4型电子天平北京赛多利斯仪器系统有限公司。

1.2实验方法

1.2.1黄浆水中还原糖含量采用DNS比色法测定黄浆水中还原糖含量［14］。

1.2.2黄浆水和豆腐中粗蛋白含量采用GB/T 5511-2008《谷物和豆类氮含量测定和粗蛋白含量计算凯氏法》［15］进行测定。

1.2.3菌种的活化牛乳在121℃条件下灭菌20min，取菌种后，接种于15mL牛奶中，在37℃下活化24h，取1mL再接种到15mL牛奶中，在37℃下活化24h，如此反复活化3～4次后，作为种子菌种备用［16-17］。

1.2.4乳酸菌的扩大培养取5mL待发酵的黄浆水与10mL试管中，121℃，灭菌20min。冷却后接入3环菌种，于37℃条件下培养24h，为一级扩大培养液。取一级扩大培养液3环，转入盛有100mL已灭菌的黄浆水的250mL三角瓶中，放入37℃培养箱中静置培养24h后备用［18］。

1.2.5产乳酸量的测定用0.1000mol/L NaOH溶液滴定发酵前后黄浆水，计算乳酸菌产乳酸量计算公式如式（1）所示

式中：C2—乳酸菌产乳酸量，g/L；C1—NaOH溶液浓度，mol/L；M—乳酸摩尔质量，g/mol；V1—NaOH滴定发酵液消耗的体积，mL；V2—NaOH滴定原始黄浆水消耗的体积，mL；V3—待测发酵液体积，mL。

1.2.6单因素实验考察乳糖添加量、黄浆水初始pH、乳酸菌接种量、培养温度和发酵时间5种因素对乳酸菌产酸量的影响。

1.2.6.1乳糖添加量对产酸量的影响在黄浆水中分别添加0%、1%、2%、3%、4%的乳糖，通过葡萄糖标准曲线确定相应的还原糖含量，黄浆水初始pH=6.0，将乳酸菌以4%的接种量接种于黄浆水中，37℃条件下培养60h后，按1.2.5测定产乳酸量，进而确定乳糖添加量。

1.2.6.2黄浆水初始pH对产酸量的影响在黄浆水中添加2%的乳糖，用NaOH和柠檬酸调pH分别为4.5、5.0、5.5、6.0、6.5进行实验，将活化后的乳酸菌以4%接种量接种于不同pH的黄浆水中，在37℃条件下培养48h。按1.2.5测定产乳酸量，进而确定黄浆水初始pH。

1.2.6.3乳酸菌接种量对产酸量的影响在黄浆水中添加2%的乳糖，调节pH=6.0，乳酸菌接种量分别为2%、4%、6%、8%、10%接种于黄浆水中，在37℃条件下培养48h。按1.2.5测定产乳酸量，进而确定最适接种量。

1.2.6.4培养温度对产酸量的影响在黄浆水中添加2%的乳糖，调节pH=6.0，乳酸菌以6%的接种量接种于黄浆水中，分别在29、33、37、41、45℃条件下培养48h。按1.2.5测定产乳酸量，进而确定最适培养温度。

1.2.6.5发酵时间对产酸量的影响在黄浆水中添加2%的乳糖，调节pH=6.0，乳酸菌以6%的接种量接种于黄浆水中，在37℃条件下分别培养48、60、72、84、96h。按1.2.5测定产乳酸量，进而确定培养时间。

1.2.7正交实验设计根据上述单因素实验，设计五因素四水平正交实验［19-21］，确定保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌共同发酵产酸的最优培养基及发酵条件。实验选取的因素及水平见表1。为验证正交实验最佳培养条件下的菌株产酸量，做三组平行实验进行复证。

1.2.8采用最优组合制作的豆腐理化指标测定利用质构仪对豆腐黏聚性及硬度进行测定。采用TPA模式。测定参数为：探头型号是P50，测试前速度为2mm/s，测试速度为1mm/s，测试后速度为1mm/s，压缩形变量是30%，触发力为5g，同一样品选择5个不同的部位测定，取平均值［22］。豆腐出品率是每100g干豆所得成品豆腐的重量。将制得的豆腐样品称量出质量，根据式（2）计算出豆腐出品率［10］。

表1　L16（45）正交实验因素水平表Table 1　FactorsandlevelsoforthogonalexperimentdesignL16（45）

式中：F—豆腐出品率，%；m豆腐—成品豆腐质量；

m干豆—干豆的质量。

1.2.9数据处理通过Excel做出不同影响因素对乳酸量影响的曲线，并通过SPSS软件对正交实验结果进行方差分析（显著水平为0.05），确定各影响因素的主次顺序及最佳优化条件。

2　结果与讨论

2.1黄浆水中还原糖、粗蛋白含量的测定

实验所得的标准曲线为：y=0.2969x-0.0091，R2= 0.9969。黄浆水中还原糖通过标准曲线计算出相应含量为0.580g/100mL。

按GB/T 5511-2008对豆腐黄浆水中粗蛋白含量进行测定，结果为0.34%。

2.2单因素实验

2.2.1乳糖添加量对菌株产酸量的影响保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌在不同乳糖添加量的黄浆水中发酵产乳酸，通过测定发酵前后NaOH消耗的体积，确定黄浆水中不同乳糖添加量对乳酸菌产酸量的影响，结果如图1所示。

图1　不同乳糖添加量对乳酸菌产酸的影响Fig.1　Lactose added effect on acid production

乳糖为乳酸菌代谢的提供碳源，能延长稳定期，随着乳糖含量的增加，使乳酸菌进入稳定期后代谢产物积累和生化反应仍继续进行，降低菌体死亡率。分析图1曲线趋势，乳糖添加量在0%～2%时，乳酸菌产乳酸量呈上升趋势，在0%～1%时产乳酸量变化显著（p≤0.05），在1%～2%时变化不显著。在2%～4%范围内乳酸量变化不显著。当添加量为2%时乳酸含量达到最大，随着乳糖含量的增加乳酸量逐渐减少。从吸光值A可知，随着乳糖浓度的增大A值先升高后降低，A值最大为0.77时乳酸量最大，即乳酸添加量为2%时达到最大，出现此情况是因为培养基中碳氮比改变，改变微生物细胞渗透压，不适合菌株的生长及代谢产物的积累。并且由于乳糖添加量越高发酵液越浑浊，作为豆腐凝固剂点豆腐会影响豆腐的外观颜色。所以，选择乳糖添加量在2%左右进行正交实验。

2.2.2黄浆水初始pH对菌株产酸量的影响保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌在不同初始pH黄浆水中发酵产乳酸，通过测定发酵前后NaOH消耗的体积，确定不同初始pH环境下的产酸量，结果如图2所示。

图2　不同初始pH对乳酸菌产酸的影响Fig.2　Initial pH effect on acid production

由图2曲线趋势知，初始pH在4.5～5.5时，乳酸量呈显著增加趋势（p≤0.05），pH在5.5～6.5范围内乳酸量显著降低（p≤0.05）。由于有机酸的积累，乳酸菌代谢多在低pH的酸性环境中进行，当环境pH降低到一定程度，乳酸菌将停止生长，影响了代谢产物的积累，所以出现了在pH=4、5条件下乳酸量降低的情况。在乳糖添加量相同时pH越大，发酵液颜色越深，作为豆腐凝固剂会影响到豆腐的外观颜色，但又由于凝固剂应用在豆腐制作过程中要尽量避免酸涩感，所以，选择pH=5.5左右进行正交实验。

2.2.3乳酸菌接种量对菌株产酸量的影响不同接种量对产酸的影响结果如图3所示。

图3　不同接种量对乳酸菌产酸的影响Fig.3　Inoculum concentration effect on acid production

接种量影响乳酸的积累，随着接种量的增加，培养环境中乳糖含量降低、pH降低，二者共同制约着乳酸菌的生长。分析图3曲线可知，接种量在2%～6%时，乳酸量呈显著增加趋势（p≤0.05），6%～8%变化不显著，8%～10%乳酸量显著降低（p≤0.05），接种量在6%左右产酸量达到最大，因此选择6%左右接种量进行正交实验。

2.2.4培养温度对菌株产酸量的影响在不同培养温度下菌株产酸情况如图4所示。

温度是乳酸菌生长代谢的重要条件，温度的不同既影响乳酸菌的生长又影响乳酸的积累。由图4可知，培养温度为37℃时，乳酸量为3.6g/L达到最大。在29～37℃范围内，乳酸量变化呈显著增加趋势（p≤0.05），在37～45℃乳酸量变化显著下降（p≤0.05）。因此，选择37℃左右的培养温度进行正交实验。该结论与尚天翠和Betache［23-24］的乳酸菌是中温微生物的结论是一致的。

图4　培养温度对乳酸菌产酸的影响Fig.4　Incubation temperature effect on acid production

2.2.5发酵时间对菌株产酸量的影响不同发酵时间对菌株产酸量的情况如图5所示。

图5　不同发酵时间对乳酸菌产酸的影响Fig.5　Fermentation time effect on acid production

随着时间的延长，代谢产物逐步积累，随着环境因子逐渐被消耗，乳酸量的积累在降低，图5的这种趋势符合这个解释。发酵时间从48～60h乳酸量呈显著增加趋势（p≤0.05），从60～96h乳酸量增加缓慢，变化不显著。在72h时产酸量为6.5g/L，84h时产酸量为6.6g/L，提高程度不高，浪费时间和资源。因此，选择发酵时间72h左右进行正交实验。

2.3正交实验结果与分析

2.3.1正交实验结果与方差分析根据以上单因素实验结果，选择乳糖添加量（A）、发酵初始pH（B）、接种量（C）、发酵时间（D）、培养温度（E）5个因素进行正交实验优化，确定各单因素对菌株产酸量的交互作用。正交实验结果如表2所示，方差分析如表3所示。

根据正交实验结果分析和方差分析可知，发酵时间具有显著性，各因素对菌株产酸量的影响主次顺序依次是：发酵时间、培养温度、接种量、黄浆水初始pH、乳糖添加量。由正交结果与极差分析表中k值知，黄浆水初始pH的k3=k4，由于pH=6.5更接近于黄浆水pH，为节约操作时间，提高效率，故选择pH=6.5（即B4）。综上各因素对产酸量交互影响最佳方案为：A1B4C3D4E2，即发酵时间为84h，培养温度为37℃，接种量为6%，黄浆水初始pH=6.5，乳糖添加量为1.5%。在该最佳培养条件下保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌共同发酵黄浆水产酸量可达5.1g/L。

表2　L16（45）正交实验结果表与极差分析Table 2　Experimental results of L16（45）orthogonal array design and range analysis

表3　正交设计方差分析表Table 3　Analysis of variance for the experimental results of orthogonal array design

2.4采用最优组合制作的豆腐理化指标测定

根据2.3所得最佳方案制备豆腐凝固剂并应用于豆腐制作过程中。对豆腐的出品率、黏聚性、硬度、蛋白质含量进行测定结果为：出品率为196.43%，黏聚性为261.42gs，硬度为419.15g，蛋白质含量9.62%。

2.5不同豆腐凝固剂制备方法比较

不同豆腐凝固剂制备方法比较结果见表4。

表4　不同凝固剂制备方法比较Table 4　Comparison of different preparation methods of coagulant

由表4可知，本方法制备的豆腐凝固剂具有一定的生理功能，并在应用中赋予豆腐特有的乳香味，且接种量小、节约资源，制备凝固剂过程较其他方法操作简便。

3　结论

以豆腐黄浆水为原料，通过保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌共同发酵制备有机酸豆腐凝固剂。经单因素实验确定各因素正交实验的水平范围，最终通过正交实验确定最佳培养基及发酵条件。最优方案为：发酵时间为84h，培养温度为37℃，接种量为6%，黄浆水初始pH=6.5，乳糖添加量为1.5%。在该最佳培养条件下保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌共同发酵黄浆水产酸量可达5.1g/L。通过验证实验验证该培养基及发酵条件具有一定的可行性与可靠性。通过正交实验验证实验验证该最佳培养基及发酵条件具有一定的可行性与可靠性。在此工艺条件下豆腐出品率为196.43%，硬度为419.15g，黏聚性为261.42gs，蛋白质含量9.62%。

本方法与其他方法相比，具有凝固剂中乳酸含量高，改善豆腐凝固剂功能性，同时提高了豆腐中蛋白质含量的优点，但操作较费时。本实验所得数据为研制新型豆腐凝固剂的研究提供基础数据。

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Optimization of culture conditions for yellow serofluid fermented by double lactobacillus to prepare organic acid coagulant

LV Bo，LI Chen-chen，LIU Ning，LI Jian*
（Key Laboratory for Food Science and Engineering of Heilongjiang Province，College of Food Engineering，Harbin University of Commerce，Harbin 150076，China）

Yellow serofluid of tofu was used as a raw material，organic acid coagulant was prepared by Lactobacillus bulgaricus and Streptococcus thermophilus fermentation.The influences of lactic acid content were investigated by initial pH，lactose content，fermentation time culture temperature and inoculate quantity. Orthogonal experiment was used to optimize carbon source and its fermentation condition.The optimize culture conditions of organic acid coagulant were showed as follows：lactose content 1.5%，initial pH=6.5，inoculate quantity 6%，culture temperature 37℃，fermentation time 84h.The lactic acid content under these conditions was 5.1g/L.Under the above process conditions，the rate of production，hardness，cohesiveness and protein content were 196.43%，419.15g，261.42gs and 9.62%respectively.Lactic acid content was increased and function of coagulant was improved by compare with other methods，protein content of tofu was also increased. Key words：yellow serofluid；Lactobacillus bulgaricus；Streptococcus thermophilus；organic acid coagulant；fermentation

TS201.3

A

1002-0306（2015）02-0212-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.02.037

2014－04－14

吕博（1990-），女，硕士研究生，研究方向：食品安全控制与分析检测。

李健（1956-），男，本科，研究方向：农产品化学与综合利用。

黑龙江省教育厅重点项目（12521z009）。