康砖茶中儿茶素、咖啡因、没食子酸HPLC-DAD分析

李建华，齐桂年，陈盛相，朱明珠（.四川农业大学园艺学院，四川雅安62504；2.四川省茶叶产品质量检验中心，四川名山62500）

康砖茶中儿茶素、咖啡因、没食子酸HPLC-DAD分析

李建华1，2，齐桂年1，*，陈盛相1，朱明珠1
（1.四川农业大学园艺学院，四川雅安625014；2.四川省茶叶产品质量检验中心，四川名山625100）

采用二极管阵列检测器（DAD）和AcclaimTM120色谱柱，建立了一种简单、灵敏分析茶叶中儿茶素、咖啡因（CAF）、没食子酸（GA）的高效液相色谱法。色谱条件：流动相为KH2PO4-乙腈系统，梯度洗脱，流速1.0mL/min，柱温25℃，进样量10μL，检测器波长为278nm。结果表明，6种儿茶素、咖啡因、没食子酸在一定范围内线性良好，相关系数为0.9991～0.9998，具有较低的日内和日间偏差，平均加标回收率在92.49%～106.08%之间，RSD小于3.59%。应用该方法对康砖茶进行分析，其GA、EGC、CAF、C、EC、EGCG、EGCG3"Me、ECG含量分别在0.0717%～1.115%、0.280%～0.660%、2.728%～4.621%、0～0.0882%、0.157%～1.238%、0.343%～7.176%、0～0.172%及0.108%～1.654%。

康砖茶，儿茶素，咖啡因，没食子酸，HPLC-DAD

茶叶中含有许多天然多酚类物质，儿茶素约占70%以上，其主要由（-）-表儿茶素（EC），（-）-表儿茶素没食子酸酯（ECG），（-）-表没食子儿茶素（EGC）和（-）-表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）组成。这些儿茶素涉及多种生物活性，如抗氧化、抗癌、抗微生物、抗病毒和抗动脉粥样硬化［1-6］。另有报道称，在儿茶素的异构体中可能与主要儿茶素一样具有活性或活性更强［7-9］，其中，主要存在于少数乌龙茶和绿茶中的（-）-表没食子儿茶素-3-O（3-O-甲基）没食子酸酯（EGCG3"Me）［10-11］，已被证明具有很强的抗过敏作用［9，12-14］。而分析茶叶中儿茶素的主要方法是高效液相色谱法（HPLC），但目前报道的方法很少用来分析甲基化儿茶素及同时测定茶叶中儿茶素与甲基化儿茶素或使用电化学检测器［15-17］。

四川黑茶起源于十一世纪前后，主要分为南路边茶和西路边茶，其中南路边茶分为康砖、金尖两个花色，主产于雅安，专销西康和西藏地区［18］。尽管康砖茶已有上千年的生产历史，但对康砖茶中儿茶素组分的报道很少，更未见对其甲基化儿茶素进行研究。因此，本研究旨在建立一种同时测定康砖茶中5种常见儿茶素（EGC，C，EC，EGCG，ECG），1种甲基化儿茶素（EGCG3"Me），咖啡碱（CAF）和没食子酸（GA）8种成分的HPLC-DAD法，以期为四川黑茶的品质质量检测与综合效益的发挥、开发新型功能茶和茶叶天然抗过敏药物都具有重要意义。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

没食子酸、咖啡碱、C、EC、EGC、EGCG、ECG标液Sigma公司；EGCG3"Me标液和日本benifuji绿茶由湖南农业大学茶学教育部重点实验室提供；康砖茶由四川省雅安市主要边茶茶厂提供。

戴安3000高压高效液相色谱仪美国Dionex UltiMate；Velocity18R离心机日本岛津；AriumComfort纯水机德国赛多利斯股份公司；DGP-3600SD泵，WPS-3000自动进样器、TCC-3000柱温箱，DAD-3000检测器，AcclaimTM120（5μm，120Å，4.6mm×250mm）C18色谱柱，通过Chromeleon®7色谱工作站控制并进行数据处理。

1.2样品提取

准确称取干燥的茶叶粉末150mg，加入50%乙腈（V/V）25mL、30℃、120r/min黑暗下浸提40min，之后8000r/min 4℃离心15min，上清液经适当稀释后，0.45μm微孔滤膜过滤，备用。

1.3色谱条件

1.3.1流动相采用6组流动相进行选择，1#：0.2%乙酸水溶液-乙腈；2#：2%冰乙酸-乙腈；3#：KH2PO4缓冲液（0.02mol/L，pH2.5）-乙腈；4#：H2O-乙腈-H3PO4（400∶10∶1）-甲醇溶液（1∶2）；5#：A为9%乙腈-2%乙酸-20μg/mL EDTA溶液，B为80%乙腈-2%乙酸-20μg/mL EDTA溶液；6#：NaH2PO4溶液缓冲液（0.1mol/L，pH2.5）-乙腈。

1.3.2梯度洗脱条件8%的B相起始，0～5min保持8%的B相不变，5～25min B相从8%线性增加到11%，25～50min B相从11%线性增加到21%，50～51min B相增加至95%，51～54min保持B相95%不变，54～55min B相从95%降至8%，56～60min保持B相8%。流速：1.0mL/min；进样量10μL。

2　结果与分析

2.1色谱条件的优化

2.1.1流动相组成的优化以6种不同的流动相对茶叶中EGCG3"Me等成分进行分离。结果表明：流动相不同，分离效果相差很大。采用1#流动相出现了CAF和C两个峰的重叠，而2#、5#流动相出现了EC和EGCG的重叠，4#流动相分离效果最差，只分离出GA，这四种流动相中总有个别儿茶素分离不开或出现峰重叠。而3#流动相KH2PO4缓冲液（0.02mol/L，pH2.5）-乙腈和6#流动相NaH2PO4溶液缓冲液（0.1mol/L，pH2.5）-乙腈分离的选择性和分离度最佳，但考虑到高浓度盐易在管路产生结晶且对色谱柱伤害较大，故选择3#流动相。

2.1.2柱温随着柱温的降低，峰的保留时间tR都在推迟。在30℃下，咖啡碱和C两个峰有部分的重叠。同样，在20℃下，EC和CAF也出现了类似的情况。而在25℃下，EGC、EGCG、EGCG3"Me等8个目标峰清晰可见，分离效果最佳。

2.1.3检测波长经过210～290nm范围的全波长光谱扫描发现，所有物质在278nm左右均有明显的吸收峰。GA、CAF、EGC、EGCG、EGCG3"Me在278nm下有最大吸收，而C、EC、ECG在280nm下有最大吸收。但C、EC、ECG在278nm和280nm下吸收值差异不显著。光谱确定的各个物质的最大吸收峰与色谱的一致。因此，278nm为最佳吸收波长。

2.1.4色谱峰的定性对目标物质色谱峰的定性，主要根据标准对照品的保留时间及对应的紫外光谱图进行对照定性，如果两者的吸收光谱特征完全相同，可认定两者是同一种化合物。GA、EGC、CAF、C、EC、EGCG、EGCG3"Me、ECG的最大吸收波长分别为：273.5、271.3、275.3、281.2、280.5、276.6、278.6、279.3nm。C的最大吸收波长大于EC，这是因为化合物的立体位阻造成反式异构体的最大吸收波长比顺式异构体大，位阻影响了共轭体系的共平面性质。甲基化EGCG的最大吸收波长也比EGCG的大。

2.2HPLC法测定茶叶中儿茶素的含量

2.2.1HPLC法分离和检测茶叶中的儿茶素儿茶素、没食子酸和咖啡碱混标HPLC色谱图见图1。从图1中可知，混标的出峰顺序为：GA，5.9min；EGC，21.1min；CAF，23.2min；C，24.5min；EC，36.4min；EGCG，37.8min；EGCG3"Me，46.7min；ECG，50.5min。简单儿茶素EGC、C比酯型儿茶素EGCG、EGCG3"Me和ECG先出峰，异构体C比表儿茶素EC先出峰。同时，按照本实验建立的样品处理方法对日本benifuji绿茶进行了测定（其色谱图见图2），EGCG3"Me的含量高达1.656%。从色谱图上可知，各种成分都能够达到基线分离的效果。

图1　混标HPLC色谱图Fig.1　Elution profiles of mixed authentic standards

图2　benifuji绿茶的HPLC色谱图Fig.2　Elution profiles of benifuji green tea

2.2.2方法的标准曲线、检测限与线性范围参照ISO 14502-2，称取各标准物质，用稳定溶液溶解后并定容作为标准储备液，将储备液进行稀释配成不同质量浓度的EGC、EGCG、EC、ECG等的混合标准溶液，每个浓度点测定三次，取平均值。以各组分浓度X（mg/L）为横坐标，色谱峰峰面积Y（mAU·min）为纵坐标作图，由表1可知，所有标液曲线方程的R2＞0.999。LOD的计算是通过将每个标准溶液逐步稀释，当信噪比（S/N=3）时的浓度即为最低检出限。大多数标液的检出限在0.2～3.0ng之间。EGC具有最高的检测限为9.12ng，其次是C为3.68ng，GA检测限最低，为0.26ng（表1）。

表1　方法的标准曲线、检出限与线性范围Table 1　Standard curves，limit of detection，and linear range of HPLC-DAD method

2.2.3方法的重复性、稳定性和回收率方法的重复性是取同一质量浓度各标准溶液在同1d连续进样6次以考察方法精密度，测定其保留时间和峰面积的相对标准偏差。结果表明，大多数标液的保留时间和峰面积RSD（%）＜1%（见表2），方法的重复性好。

表2　HPLC-DAD方法的重复性、稳定性和回收率Table 2　Repeatability，reproducibility，and recovery of HPLC-DAD method

日内精密度是在同一天连续5次测定同一样品，日间精密度是同一样品连续3d测定，每天测定3次，取平均值。结果表明，日内和日间精密度的RSD大多在6%以下，所有样品组分测定结果表明日内精密度的RSD（%）均小于日间精密度的RSD（%）（见表2），这与Bing Hu等研究结果（即方法的日内精密度小于日间精密度）相一致［10］。没食子酸，6种儿茶素和咖啡碱都具有较低的日内和日间偏差，表明方法的稳定性和重现性好。

回收率是取已知含量的样品，加入不同浓度的对照品3次，处理样品后进行测定，计算各组分的回收率。结果表明回收率在92.49%～106.08%之间，RSD小于3.59%（见表2）。

2.3HPLC法在四川康砖茶检测中的应用

康砖茶的HPLC色谱图见图3，儿茶素及甲基化儿茶素的含量见表3。结果表明，部分康砖中含有EGCG3" Me，含量在0～0.172%之间，含量最高的是康砖1，只有康砖4中不含甲基化儿茶素。EGC、EC、EGCG、ECG含量最高的是康砖1，含量分别为0.660%、1.238%、7.176%、1.654%。CAF含量最高的是康砖2，含量高达4.621%。C、GA在康砖5含量最高，GA含量高达1.115%。

图3　康砖1的HPLC图Fig.3　Elution profiles of kangzhuan tea1

表3　康砖中儿茶素、咖啡因、没食子酸的含量（%）Table 3　Content of catechins，caffeine，gallic acid in Kangzhuan tea（%）

3　结论与讨论

本实验采用DAD和AcclaimTM120（5μm，120Å，4.6mm×250mm）色谱柱，建立了一种同时检测四川黑茶康砖茶中5种常见儿茶素、1种甲基化儿茶素（EGCG3"Me），咖啡碱和没食子酸的高效液相色谱法，本方法简单易行，重复性好、稳定性强、回收率高。同时，还发现了部分康砖茶中含有EGCG3"Me，但其含量相对于不发酵日本benifuji绿茶EGCG3"Me含量（1.656%）比较低，这主要由于黑茶是发酵茶，大部分的儿茶素（EGCG3"Me）随着加工过程而被微生物酶作用下氧化聚合破坏［10］。

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Analysis of catechin，caffeine and gallic acid in Kangzhuan tea by HPLC-DAD

LI Jian-hua1，2，QI Gui-nian1，*，CHEN Sheng-xiang1，ZHU Ming-zhu1
（1.College of Horticulture，Sichuan Agricultural University，Ya’an 625014，China；2.The Quality Examination Center of Sichuan Tea，Mingshan 625100，China）

A High-performance Liquid Chromatographyhigh method with a diode array detector（DAD）and AcclaimTM120 as column，was established for simultaneous analysis of tea catechins，caffeine（CAF），and gallic acid（GA）.Its chromatographic conditions were as follows：mobile phase of KH2PO4and acetonitrile，gradient elution，flow rate of 1.0mL/min，temperature of column 25℃，sample amount 10μL，Detector wavelength 278nm. The results showed that six kinds of catechins，caffeine，gallic acid were in a range of good linearity correlation coefficient of 0.9991 to 0.9998，with low intra-and inter deviation，the average recovery between 92.49%～106.08%，and the relative standard deviation（RSD）of less than 3.59%.Futhermore，This method was applied to analyze Kangzhuan tea，its GA，EGC，CAF，C，EC，EGCG，EGCG3"Me，ECG contents were between 0.0717%～1.115%，0.280%～0.660%，2.728%～4.621%，0～0.0882%，0.157%～1.238%，0.343%～7.176%，0～0.172%and 0.108%～1.654%，respectively.

Kangzhuan tea；catechin；caffeine；gallic acid；HPLC-DAD

TS272.7

A

1002-0306（2015）02-0075-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.02.007

2014-05-12

李建华（1984-），女，在读博士研究生，研究方向：茶叶加工理论与技术。

齐桂年（1956-），男，博士研究生，教授，研究方向：茶叶精深加工。

四川省科技成果转化重点项目（12CGZHZX0579）；四川省科技支撑计划项目（14ZC1700）。