基于旋光法的原料乳中乳糖掺伪鉴别技术研究

郑向华，杨自洁，龚吉军，，，*，张青燕，邓放明，肖莲荣

（1.中南林业科技大学食品科学与工程学院，湖南长沙410004；2.厦门出入境检验检疫局科学研究院，福建厦门361026；3.湖南亚华乳业有限公司，湖南长沙410013；4.湖南农业大学生物学博士后流动站，湖南长沙410128）

基于旋光法的原料乳中乳糖掺伪鉴别技术研究

郑向华2，杨自洁1，龚吉军1，3，4，*，张青燕3，邓放明4，肖莲荣3

（1.中南林业科技大学食品科学与工程学院，湖南长沙410004；2.厦门出入境检验检疫局科学研究院，福建厦门361026；3.湖南亚华乳业有限公司，湖南长沙410013；4.湖南农业大学生物学博士后流动站，湖南长沙410128）

旨在建立一种简便、高效的原料乳乳糖掺伪鉴别方法。以三氯乙酸为沉淀剂进行前处理，借助旋光仪，在589.30～589.44nm下，测定标准乳糖溶液的旋光度，绘制标准曲线，建立了一种基于标准曲线的原料乳乳糖掺伪定量鉴别法。所得回归方程的线性相关系数R2=0.9993，平均回收率达99.0%，相对标准偏差（RSD）为0.67%。与莱因-埃农氏法进行比对实验，结果无差异，但更快捷，成本更低。研究结果提示，本文所建方法实用、可靠。

原料乳，乳糖，旋光法，掺伪检测

乳糖是原料乳中的主要碳水化合物，是半乳糖经β-1，4糖苷键与葡萄糖结合而成的还原性二糖。乳糖的主要功能是为人体供给热能，此外，还可促进机体尤其是婴幼儿对钙的吸收，而乳糖分解生成的半乳糖是组成大脑配糖体的重要成分。因此，其对婴儿的生长发育具有重要的作用［1-2］。乳糖含量虽然不是国家生鲜乳收购标准中的检测项目，但为防止原料乳掺假，乳品企业在收购时大多将其列为检测项目［3］。

目前乳制品中碳水化合物测定的国家标准方法是GB5413.5-2010，有关乳糖的检测方法有两种，一是高效液相色谱法，二是莱因-埃农氏法。高效液相色谱法高效且准确，但设备昂贵，检测费用相对较高；而莱因-埃农氏法，较繁琐、费时，且不易判断终点。因此，建立一种更便捷且准确的原料乳及乳制品中乳糖检测/鉴别法，具现实意义。经典旋光法是测定牛乳中乳糖含量的传统方法之一［4］，但该方法冗长费时、不易操作，工作效率较低。为此，笔者将经典旋光法进行了改进，建立了一种高效、简便、低成本的原料乳中乳糖掺伪鉴别方法，以期为原料乳生产实践中的掺伪鉴别提供参考。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

乙酸铅、草酸钾、磷酸氢二钠、硫酸铜、酒石酸钾钠国药集团化学试剂有限公司；三氯乙酸国药集团化学试剂有限公司；乳糖国药集团化学试剂有限公司；生乳、乳清粉（乳糖含量为72.92g/100g） 湖南亚华乳业有限公司提供；以上试剂均为国产分析纯试剂；实验用水均为纯水。

AR2140电子分析天平上海力衡仪器仪表有限公司；1600型分光光度计上海精密科学仪器有限公司；TDL80-2B高速离心机上海贤德实验仪器有限公司；WZZ-2A型数字自动旋光仪上海垒固仪器有限公司。

1.2实验方法

1.2.1沉淀剂对乳糖溶液旋光度的影响参考文献［5］的方法，选用浓度24%三氯乙酸作为沉淀剂。分别向100m L浓度为1mg/m L的乳糖溶液中（其中添加3.0g全脂奶粉）加入浓度24%三氯乙酸4、5、6m L，摇匀，静置5min，放入2dm旋光管中，每小时测定1次旋光度，考察沉淀剂对旋光度的影响，以确定最佳的沉淀剂添加量与检测时间。以蛋白质沉淀率来表示沉淀剂的沉淀效果。

蛋白质沉淀率（%）=沉淀物中所含蛋白质质量/被测体系中所含蛋白质质量×100。

1.2.2乳糖溶液配制及前处理乳糖在80℃下，烘2h，备用。分别加入0、0.1、0.2、0.3、0.5、0.7、1.0、1.5、2.0、3.0g乳糖，用蒸馏水定容至100m L，充分摇匀，配制系列浓度的乳糖溶液。加入浓度24%三氯乙酸5m L，摇匀，静置10min后，过滤，滤液备用。

1.2.3乳糖标准曲线的绘制依次移取1.2.2中所得滤液置于2dm旋光管中，在589.30～589.44nm［6］测定旋光度。以乳糖浓度为横坐标，旋光度为纵坐标，绘制标准曲线。

1.2.4回收率实验在10m L原料乳中，分别掺入乳糖10.00、20.00、30.00、50.00、70.00、100.00、150.00、200.00、300.00mg，用蒸馏水定容至100m L。采用前述方法进行前处理后，用旋光仪测定旋光度，每个浓度梯度重复测定5次。

1.2.5精密度实验在10m L原料乳中，添加30.00mg乳糖，用蒸馏水定容至100m L，充分摇匀。采用前述方法进行前处理后，用旋光仪测定旋光度。重复6次。

1.2.6与莱因-埃农氏法的比对实验在两份10m L原料乳中，分别添加30.00mg乳糖和40.00mg乳清粉，用蒸馏水定容至100m L。用前述方法进行前处理后，采用所建旋光法测定样品中乳糖的含量。同时参照国标GB5413.5-2010中莱因-埃农氏法进行比对实验。每种方法设6次重复，据测定结果计算回收率，依此进行检测效果比对。

1.2.7数据处理采用PASW Statistics软件对结果进行统计分析。

2　结果与分析

2.1温度对旋光度的影响

就大多数光学活性物质而言，当温度升高1℃时，旋光率约减小千分之几，一些利用旋光法检测碳水化合物的研究中，探究了温度对测定结果的影响，并计算出了温度校正系数［6-7］。朱亚菲［8］报道，在24～60℃的范围内，温度对蔗糖的旋光度基本无影响。而童殿荣［9］在用旋光法测定新鲜牛乳中乳糖的研究中，亦得出了相似的结论。对此，笔者也进行了大量预实验，研究发现，基于标准曲线的旋光法，在10～30℃的条件下，温度对旋光度的影响可忽略。故此，在本项研究中，不考虑温度对旋光度的影响。

2.2沉淀剂对乳糖溶液旋光度的影响

目前，乳制品中乳糖检测时常用的蛋白沉淀剂有硫酸锌-氢氧化钡、乙酸锌-亚铁氰化钾和硫酸锌-氢氧化钠［2，10］。伍桃英等［11］的研究认为，乙酸铅和草酸钾-磷酸氢二钠沉淀蛋白质的效果较好。而刘志祥等［12］用旋光法测定乳清粉中乳糖时发现，即使不加沉淀剂，亦可获得满意的效果。在参考谢家兴［5］及预实验的基础上，本文采用了24%三氯乙酸作为蛋白沉淀剂。而三氯乙酸为酸性，其对乳糖溶液的旋光度是否有影响，未见文献报道。

三氯乙酸的加入量对乳糖溶液的旋光度影响的测定结果见表1。由表1可见，在相同的时间，随着24%三氯乙酸添加量的增加，三个样品的旋光度有所增大。随着时间的延长，三个样品旋光度值的变化趋势基本一致，即旋光度先快速降低，后变化幅度减缓至趋于稳定；添加量为4、5m L/100m L时，3h后趋于稳定，添加量为6m L/100m L时，2h后趋于稳定。

表1　不同三氯乙酸添加量对应的旋光度Table 1　The optical rotation under different contents of trichloroacetic acid

蛋白质沉淀率测定结果见表2。表2的结果表明，随着三氯乙酸的添加量增加，蛋白质沉淀率上升，当添加量为5m L/100m L时，已基本沉淀完全。

表2　蛋白质沉淀率测定结果（±SD，n=5）Table 2　The data of precipitation rate of raw milk protein（±SD，n=5）

表2　蛋白质沉淀率测定结果（±SD，n=5）Table 2　The data of precipitation rate of raw milk protein（±SD，n=5）

注：同行不同小写字母表示差异显著（p＜0.05），相同则差异不显著（p＞0.05）；表5同。

指标　24%三氯乙酸添加量（mL/100mL）4 5 6蛋白质沉淀率（%）　94.3±0.2a　99.5±0.1b　99.9±0.1b

综合旋光度变化与沉淀效果的情况，最终确定24%三氯乙酸的适宜添加量为5m L/100m L，滤液上机检测前需静置3h。

2.3乳糖溶液标准曲线的绘制

乳糖溶液标准曲线见图1。在0～3.0g/100m L的范围内，回归方程y=0.5198x+0.0101，相关系数R2=0.9993，说明此标准曲线的线性相关性好。

图1　乳糖溶液标准曲线Fig.1　The standard curve of lactose solution

2.4回收率实验

回收率测定结果见表3。由表3可见，乳糖的平均加标回收率在97.5%～100.9%之间，综合平均回收率为99.0%。

2.5精密度实验

为了验证所建方法的可靠性，进行了精密度实验。剔除原料乳本身所含乳糖（即本底值）后，测定结果如表4所示。表4的结果表明，原料乳重复性实验的RSD在1%以内，说明该方法的精密度高。同时，精密度实验中的回收率也很高。这一结果提示，本法精确可靠。

表3　乳糖掺伪原料乳回收率实验结果Table 3　Results of recovery experimentof lactose in raw milk

表4　精密度实验结果Table 4　Results of the precision test

表5　比对实验结果（x±SD，n=6）Table 5　The results of comparison tes（tx±SD，n=6）

2.6与莱因-埃农氏法的比对实验

为了进一步验证本文所建立方法的准确性与实用性，将此法与国家标准GB5413.5-2010中莱因-埃农氏法进行了比对实验，结果见表5。表5的结果表明，采用两种不同方法所得结果没有显著差异（p＞0.05）。因对前处理进行了改良，整体来讲本文所建方法总耗时比莱因-埃农氏法要短，且所用试剂明显比后者要少，故更为快捷、经济。比对实验结果提示，在检测条件较为简陋的中小企业或奶站，本文建立的方法具有很高的推广利用价值。

3　结论

在0～3.0g/100m L，本文建立的旋光法测定原料乳中乳糖掺伪的线性回归方程为y=0.5198x+0.0101，R2为0.9993，线性相关性好。通过回收率实验、精密度实验以及与现行国标方法即莱因-埃农氏法的比对实验，证实该方法是一种简便、快捷、准确的定量鉴别方法，同时，该方法还具有成本低、对检测人员要求不高的优点，因而具有较高的实用价值。

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［4］韩绍攻，冷友斌.改良旋光法测定牛乳中的乳糖［J］.中国乳品工业，1991，19（5）：207-208.

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Study on the technology of identify the lactose adulteration in raw m ilk based on polarimetric method

ZHENG Xiang-hua2，YANG Zi-jie1，GONG Ji-jun1，3，4，*，ZHANG Qing-yan3，DENG Fang-m ing4，XIAO Lian-rong3
（1.College of Food Science and Engineering，Central South University of Forestry and Technology，Changsha 410004，China；2.Institute，Xiamen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Xiamen 361026，China；3.Post-doctoralWorking Station，Hunan AWA Dairy Co.，Ltd.，Changsha 410013，China；4.Post-DoctoralMobile Station of Biology，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，China）

This paper was aimed to set a sim p le and highly-efficientmethod for lactose adulteration detection in raw m ilk.After p retreatment using trichloroacetic acid as p recipitant，at 589.30～589.44nm，the op tical rotation was measured by polarimeter to create standard curve about standard lac tose solution.So as to estab lish a polarimetric method for quantitative detection of the lactose adulteration in raw m ilk based on standard curve. The correlation coefficent（R2）of this regression equation acquired in our study was equivalent to 0.9993；the average recovery rate was 99.0%；the relative standard deviation was 0.67%.In the comparison test，the results showed no significant difference between the Laing Henon'method and the one estab lished in this study，

raw m ilk；lactose；polarimetric method；adulteration detection

TS252.7

A

1002-0306（2015）06-0075-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.06.008

2014-09-01

郑向华（1976-），女，硕士研究生，高级工程师，研究方向：食品质量与安全。

龚吉军（1972-），男，博士，教授，研究方向：食品质量与安全，天然食品保鲜剂开发与利用。

国家十二五科技支撑计划课题（2012BAD12B04）；国家质检总局科技计划项目（2013IK186）。

but the latter was sim p ler and cheaper than the former.It was suggested that such method was p ractical and reliab le.