柴胡口服液HPLC指纹图谱及柴胡皂苷b2的含量检测分析

何红晖

（长春中医药大学附属医院，吉林 长春 130021）

柴胡口服液HPLC指纹图谱及柴胡皂苷b2的含量检测分析

何红晖

（长春中医药大学附属医院，吉林 长春 130021）

目的 根据柴胡口服液HPLC指纹图谱及柴胡皂苷b2的含量，提供评价质量的方法。方法 根据HPLC方法对5批柴胡口服液进行测定，并根据中药色谱指纹图谱相似度评价系统，建立柴胡口服液标准指纹图谱，并测定每批制剂柴胡皂苷b2的含量以及制剂的相似度。结果 5批柴胡口服液的HPLC指纹图谱共有5个峰，相似度＞0.945，柴胡皂苷b2在0.0395～0.7935 μg显示存在良好的线性关系。结论 柴胡口服液制剂与标准指纹图谱对比评价质，操作方便，可有效用于评价柴胡口服液的质量。

柴胡口服液；HPLC指纹图谱；柴胡皂苷b2

柴胡口服液为一种单味制剂，主要是由柴胡挥发油和柴胡水煎液混合而形成，其具有解表退热，症见口干而渴、头痛身楚、身热面赤功效。为了保证用药质量，采用薄层色谱法评价柴胡口服液的质量［1-2］。本次研究中，提出柴胡口服液HPLC指纹图谱研究方法，并对柴胡皂苷b2含量进行测定，其应用更为方便高效，报道如下。

1　材 料

高效液相色谱仪，色谱工作站，电子天平，超纯水器，数显式电热恒温水浴锅，中药色谱指纹图谱相似度评价系统。柴胡口服液，柴胡皂苷b2对照品，甲醇、乙腈为色谱纯，水为超纯水。

2　方 法

2.1色谱条件：色谱柱为（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相水（A）-乙腈（B），洗脱程序0～20 min，30%～38%B，20～25 min，38%～40%B，25～35 min，40%～50%B；35～45 min，50%～60%B；45～45.5 min，60%～30%B。45.5～50 min，30%B；45.5～50 min，30%B。柱温设置为25 ℃，流速为1 mL/min，检测波长为252 nm，进样体积为10 μL。柴胡皂苷b2理论塔板数应高于5000。

2.2制备供试品溶液：取2 mL柴胡口服液，之后通过SPE小柱，依次采用20 mL 50%甲醇和甲醇10 mL洗脱为对照组，甲醇洗脱部位作为供试品。洗脱液分别采用水浴浓缩到干燥，残渣采用甲醇定容到2 mL，并经过0.45微孔滤膜。

2.3阴性供试品溶液制备：根据处方的比例，称取不包括柴胡敷料，并根据药典工艺将其制备成阴性供试品溶液。

2.4制备对照品溶液：取柴胡皂苷b2作适量对照品，并按照精确的剂量称取，之后将甲醇加入其中，制作出1 mL含量79.33 μg的溶液，并将其放置于10 ℃下环境中留作保存。

2.5对照组实验：取出剂量分别为10 μL对照品、样品溶液、阴性、50%甲醇洗脱液以及50%甲醇洗脱液与适量的柴胡皂苷b2，将其注入到高效液相色谱仪中，根据2.1色谱条件取样，详细记录到色谱图中。

2.6考察线性关系：按照所需剂量称取2.3项目下柴胡皂苷b2对照品溶液，并与甲醇进行稀释，分别得出6个不同质量浓度，分别为79.32，51.93，39.87，15.97，7.68，3.91mg/L，并根据2.1色谱条件分别取样10 μL，其中横坐标为进样量（X），纵坐标为峰面积（Y），绘制标准曲线，得出的线性回归方程为Y=19282X-78487（r=0.992），研究结果表明，柴胡皂苷b2进样量为0.0387～0.7924 μg与峰面积显示为良好的线性关系。

2.7精密度试验：取出同一供试品溶液，根据2.1的色谱条件连续取样5次，详细记录色谱图中共有峰面积，计算出5次RSD，各共有峰的RSD均＜3%，研究结果表明仪器的精密度显示仪器良好。

2.8重复性试验：分别制备出5份供试品溶液，并按照2.1的色谱条件取样，记录各共有峰峰面积，计算5分平行样品间的RSD＜3%，与指纹图谱要求相符，显示有良好的重复性。

2.9稳定性试验：将供试品溶液制备出，并将其放置在室温条件下，在相同条件下分别在0、4、8、12、24 h等各个时段进行分析研究，考察供试品溶液当天的稳定性。观察可见共有峰峰面积RSD＜3%，与指纹图谱要求相符，表明样品在24 h处于稳定状态。

2.10加样回收率实验：取出已知含量的柴胡口服液1 mL样品，并分别将其放置于浓度为1 mL的柴胡皂苷b2对照品溶液中，并根据2.2项下平行操作6份，根据2.1色谱条件取样分析。计算出加样回收率，并计算出RSD。

表1　柴胡口服液5批柴胡口服液样品相对峰面积

3　结 果

3.1建立柴胡口服液的HPLC指纹图谱：根据2.2项下制备的5批柴胡口服液样品，以2.1项下色谱条件进样，并详细记录各色谱图，按照6号峰作为参照峰，计算出各有峰相对峰面积，结果具体见表1。

3.2柴胡口服液含量测定：柴胡口服液根据2.2项下制备，测定柴胡皂苷b2含量，具体见表2。

表2　柴胡口服液中柴胡皂苷b2含量（mg/L）

4　讨 论

4.1选择样品处理方法：根据色谱图形比较不同的样品处理方法，并根据本次实验方法，采用SPE小柱实施样品前处理，分别采用10 mL水+30%甲醇20 mL，10 mL甲醇+10 mL 50%甲醇，20 mL 50%甲醇，分别对柴胡口服液实施杂质洗脱，可见20 mL 50%甲醇洗脱后得出的色谱图效果更良好［3］。

4.2考察除杂容积：同样品的处理方法，取出50%甲醇20 mL洗脱液，水浴蒸干，50%甲醇定容为2 mL，并经过0.45微孔进行滤膜，平行1份将适量的柴胡皂苷b2作为对照品，并按照2.1色谱条件进样分析，应保证无柴胡皂苷b2的任何流失［4］。

4.3选择色谱条件：首先应考虑流动相水-乙腈不同梯度的洗脱情况，经试验结果显示可见所用条件的所得峰形好、分离效果良好，且基线比较平稳，有利于分析指纹图谱以及柴胡皂苷b2定量。

4.4选择检测波长：本次研究中采用的检测器为二极管阵列紫外检测器，首先在2.1色谱条件下才也难怪全波长进行扫描测定检查，并在199～400 nm下采集三维色谱图，并综合考虑三维色谱图所在波长下的出峰情况、基线平稳程度以及各成分的具体分离情况，考虑可采用252 nm的波长。指纹图谱可将6号峰作为内参照峰，因其保留时间居中大约为23.52 min，且分离效果良好［5］。

［1］刘伟，杨艳玲，刘乃强.柴胡口服液HPLC指纹图谱及柴胡皂苷b2的含量测定［J］.中国实验方剂学杂志，2013，19（8）：134-135.

［2］李艳荣，崔凤侠，杜义龙.柴胡的HPLC指纹图谱研究［J］.华西药学杂志，2013，28（1）：86-88.

［3］李军，姜华，石任兵.HPLC法测定柴胡口服液中柴胡皂苷b2的含量［J］.药物分析杂志，2009，29（5）：743-745.

［4］赵丽，钟巧妮，雷玉霞.柴胡总苷高效液相色谱指纹图谱与主成分含量测定［J］.医药导报，2008，27（3）：323.

［5］李棣华，刘俊红，伍孝先.山西产柴胡中皂苷类成分HPLC指纹图谱初步研究［J］.辽宁中医药大学学报，2011，13（5）：89-90.

R9

B

1671-8194（2015）012-0044-02