儿童异型淋巴细胞增多与CMV、EBV感染相关性研究

章浙忠　许健骆丰　杨啸晓

儿童异型淋巴细胞增多与CMV、EBV感染相关性研究

章浙忠许健★骆丰杨啸晓

目的 探讨患儿感染CMV、EBV后，异型淋巴细胞数量与CMV-IgM、CMV-IgG、CMV-DNA、EBV-IgM、EBV-IgG水平，以及与CMV-DNA和EBV-DNA之间的相关性，为患儿治疗CMV和EBV提供实验室依据。方法 收集异型淋巴细胞增多（阳性：异型淋巴细胞＞3%）儿科临床病例95例，采用ELISA法检测患者血清中CMV-IgM、CMV-IgG、EBV-IgM、EBV-IgG水平，Real-time PCR法检测患者CMV-DNA 和EBV-DNA含量，瑞吉染色计数异型淋巴细胞。结果 95例异型淋巴细胞阳性患者体内CMV-IgM和EBV-IgM阳性率达1.1%和5.3%；CMV-IgG和EBV-IgG阳性率为52.6%和31.6%；PCR结果显示CMV-DNA和EB-DNA阳性率分别为17.9%和22.1%。其中50例CMV-IgG检测阳性的患者CMV-DNA阳性率高达30%；30例EBV-IgG检测阳性的患者EBV-DNA阳性率高达36.7%；5例EBV-IgM检测阳性的患者仅1例EB-DNA检测为阴性。结论 异型淋巴细胞增多与CMV、EBV感染具有一定的相关性，且CMV-IgG和EBV-IgG在诊疗过程中具有一定临床意义。怀疑患儿感染CMV和EBV时，合并异型淋巴细胞、CMV-IgM、CMV-IgG、CMV-DNA、EBV-IgM、EBV-IgG以及EBV-DNA水平联合诊断对临床具有重要意义。

异型淋巴细胞 巨细胞病毒 EB病毒

异型淋巴细胞又称病毒细胞、非典型淋巴细胞、传染性单核细胞等，多见于EB病毒（EBV）和巨细胞病毒（CMV）等感染［1］。传染性单核细胞增多症是指EBV感染引起的单核-巨噬细胞系统性增生性传染病。但近期研究发现CMV病毒亦可引起传染性单核细胞增多综合征［2］，可经血清学检测IgM抗体阳性或PCR检测DNA阳性诊断［3，4］。作者对血液中存在异型淋巴细胞患者血清中的CMV-IgM、CMV-IgG、CMV-DNA、EBV-IgM、EBV-IgG水平以及EBV-DNA、CMV-DNA水平进行检测，并观察CMV和EBV感染阳性患者外周血中异型淋巴细胞的改变，综合分析比较它们之间的联系，为医务人员诊断EBV和CMV感染提供参考依据。

1　材料与方法

1.1标本来源 收集2012年1月至2014年9月于浙江省中医院儿科有异型淋巴细胞增多血液标本95例，其中男45例，女50例；1～7岁占84.2%，其他年龄段占15.8%。

1.2仪器与试剂 双目光学显微镜；实时荧光定量PCR仪（ABI，USA，ABI7500）；酶标仪（宝特，USA，ELX808）；EBV核酸定量检测试剂盒（达安基生物有限公司）； CMV病毒核酸定量检测试剂盒（达安基生物有限公司）； CMV ELLSA试剂盒（美国美德声科学技术公司）；EBV ELISA试剂盒（北京贝尔生物工程有限公司）。瑞吉染液（珠海贝索生物技术有限公司）。

1.3方法 （1）按《全国临床检验操作规程》［5］的要求制备2张良好血涂片，瑞吉染液染色，异型淋巴细胞数＞3%为阳性。（2）分离血清用ELISA检测试剂盒检测CMV-IgM、CMV-IgG、EBV-IgM、EBV-IgG水平。（3）实时荧光定量PCR仪检测血标本中CMV-DNA和EBV-DNA水平。①标本处理：患者静脉血分离血清，取50μl血清加50μlDNA提取液混匀，离心后取含病毒DNA上清液5μl做PCR扩增。②取预混有引物的PCR反应管，加入含病毒DNA上清液，将反应管放入PCR仪的样品槽内，按对应顺序设置阴性、阳性定量质控参考品梯度以及未知标本，并设置样品名称、标记荧光基团种类和循环参数，反应结束后仪器自动分析计算出标本数值（Qty）。③阳性判断：CMVDNA＞2.5×104copies/ml；EBV-DNA＞5.0×104copies/ml。

2　结果

2.1瑞氏-吉姆萨染色液染色手工分类 95例标本中89例为单核型的异型淋巴细胞，4例为单核型和和浆细胞型混合感染的异型淋巴细胞，2例为幼稚型的异型淋巴细胞。见图1～3。

图1　幼稚细胞型异型淋巴细胞

图2　单核细胞型异型淋巴细胞

图3　浆细胞型异型淋巴细胞

2.2异形淋巴细胞阳性患者血清 CMV-IgM、IgG， EBV-IgM、IgG的 ELISA检测结果以及EBV-DNA 、CMV-DNA 的PCR检测结果 见表1。

表1　异型淋巴细胞检测阳性血清CMV-IgM、CMV-IgG、EBV-IgM、EBV-IgG、EBV-DNA和CMV-DNA检测结果（n）

2.3CMV-IgG和EBV-IgG阳性患者的血清CMV-DNA和EBV-DNA PCR检测结果 见表2。

表2　CMV-IgG和EBV-IgG阳性患者中CMV-DNA和EBV-DNA 检测结果（n）

2.4CMV-IgM和EBV-IgM阳性患者的血清CMV-DNA和EBV-DNA PCR检测结果 见表3。

表3　CMV-IgM和EBV-IgM阳性患者血清CMV-DNA和EBV-DNA检测结果（n）

3　讨论

传染性单核细胞症临床表现以小儿发热、咳嗽、淋巴结和肝脾肿大等症状为主［6］。EBV是一种嗜B淋巴细胞的疱疹病毒，可引起典型的传染性单核细胞增多症表现［7，8］，或呈隐性感染状态并终生带毒［9，10］。文献提示EBV可引起脑炎［11］、脑膜炎、多发性硬化症等神经系统疾病。CMV具有潜伏-活动的生物学特征［12］，可引起神经性耳聋和不同程度的神经运动障碍。异常淋巴细胞形态各异，一般分三型：Ⅰ型为泡沫型，其染色质呈粗网或成堆排列，核偏位，胞浆中有大小不一泡沫样空泡；Ⅱ型是不规则型，核圆、椭圆或不规则，染色质稍细呈单核样，胞浆丰富； Ⅲ型是幼稚型，染色质细致均匀，可见核仁。对存在异型淋巴细胞患者的血清进行CMV-IgM、CMV-IgG、CMV-DNA、EBV-IgM、EBV-IgG以及EBV-DNA检测，患者血清中CMV和EBV抗体的检出说明患者体内存在CMV和EBV早期或既往感染，同时也论证了异型淋巴细胞与CMV和EBV具有一定的相关性。CMV和EBV感染后患者以Ⅱ型异常淋巴细胞为主，主要表现为胞浆增多，染色质单核样改变为主，少见泡沫型和幼稚型。患者体内出现的反应性变异 T 淋巴细胞增多，故有淋巴结肿大的表现［13］。

CMV和EBV均属疱疹病毒科，为双链线状DNA病毒［14］。儿童主要通过胎盘、母乳等方式感染CMV。当小儿机体免疫缺陷或免疫系统处于抑制状态，则易引起肺炎或神经系统发育障碍等疾病。EBV具有嗜B淋巴细胞的特征，能够在已产生抗体的宿主细胞内持续存在［15］。儿童感染EBV后症状表现不一，在早期易发生误诊［16］。CMV-IgM和EBV-IgM可作为急性感染的诊断指标，因半衰期较短，可在体内持续3个月。从患者血清中检出IgM抗体，表明患者最近发生了病毒感染。CMV-IgG和EBV-IgG是既往病毒感染后，机体自身免疫产生的抗体，表明患者对该病毒具有免疫力。CMV和EBV DNA呈阳性，表明患者体内存在病毒感染。IgM阳性、DNA阳性，考虑急性的早期感染期已过，IgM型抗体在血中的滴度已下降，机体通过自身免疫开始产生抗病毒的IgG，病毒还在机体内不断复制［17］。不容忽视的是，CMV和EBV均具有潜伏性，因此极有可能在潜伏期后，人体抵抗力低下时，又出现病毒活动。因此儿童在CMV-IgG和EBVIgG检测为阳性，且符合病毒感染症状时，更应注重CMV-DNA和EBV-DNA的及时检测。对CMV-IgM和EBV-IgM阳性患儿的血清同时进行PCR检测，当IgM和DNA均呈阳性时，既是发病早期又是病毒复制期（但儿童患者免疫反应较弱，可呈假阴性），故应积极治疗，避免病情的加重。

不同方法的检测结果代表着不同的临床意义，ELISA法虽然特异性较高，但病毒需达到纳克水平。PCR检测具有敏感度高，快速简便等优点，但特异性不高。因此，怀疑患儿感染CMV和EBV时，对异型淋巴细胞以及CMV-IgM、CMV-IgG、CMV-DNA、EBV-IgM、EBV-IgG和EBV-DNA联合检测对诊断具有重要的意义，为临床医生综合分析病情，降低误诊，及早、及时、有效治疗表明患者体内存在病毒感染。IgG阳性、DNA阳性感染患儿提供实验室依据。

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Objective Probe the correlation of atypical lymphocyte with CMV-IgM， CMV-IgG， CMV-DNA， EBV-IgM， EBV-IgG and EBV-DNA in pediatric patients， provide experimental basis for treatment of CMV and EBV infection in children patients. Methods Collected 95 samples of atypical lymphocyte more than 3% from clinic pediatrics， detected the level of CMV-IgM， CMV-IgG， EBV-IgM and EBV-IgG by ELISA， analyzed the copies of CMV-DNA and EBV-DNA with real time PCR， and the peripheral blood smears were stained by Wright-Giemsa. Results There were 1.1% CMV-IgM， 5.3% EBV-IgM， 52.6% CMV-IgG and 31.6% EBV-IgG positive were discovered in 95 children patients of atypical lymphocyte increased by ELIAS， 17.9% CMV-DNA and 22.1% EBV-DNA were confi rmed by PCR， respectively. 30% CMV-DNA positive patients were found at 50 samples with CMV-IgG； 36.7% EBV-DNA were found at 30 cases with EBV-IgG. There was only one EBV-DNA negative in 5 casws with EBV-IgM. Conclusion Results showed that atypical lymphocyte increased has correlation with CMV-DNA， EBV-DNA， CMV-IgG and EBV-IgG， it will provide a clinical reference for the diagnosis and treatment of CMV and EB infection.

Atypical lymphocyte CMV EBV

浙江省科技厅钱江人才项目（2013R10072）； 浙江省自然科学基金（LY14H160037）

310012 浙江中医药大学附属第一医院（章浙忠 骆丰 杨啸晓）310053 浙江中医药大学医学技术学院（许健）*通讯作者