高效液相色谱法同时测定预混合饲料中维生素C、维生素B2及其磷酸盐

索德成， 赵小阳， 李 兰

（中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，北京 100081）

维生素B2和维生素C是动物维持生命和生产的重要物质。由于大多数动物不能自身合成，需要在饲料中添加以满足其生长需求。但由于受维生素C的稳定性和维生素B2的溶解度限制，其磷酸盐形式维生素C-2-磷酸酯（VCP）和维生素B2-5-磷酸钠（VB2P）也在饲料中广泛应用（陈丽和孙宏民，2004；Powers，2003）。 目前维生素 C、维生素B2、VCP和VB2P的检测主要采用酶解法、微生物法、荧光法、高效液相色谱法 （HPLC）（San José Rodriguez等，2012；贾彤和陈冰，2009；海沙尔·吐热别克和塔依尔·斯马依，2009）。酶解法需利用特定的磷酸酶将维生素B2磷酸钠或维生素C磷酸酯转化成维生素B2或维生素C后测定。但是磷酸酶价格昂贵，对于复杂的预混合饲料提取无法取得满意的结果（贾彤和陈冰，2009）。荧光法操作复杂，抗干扰能力差，难以用于预混合饲料的测定。目前对维生素C、维生素B2、VCP、VB2P和其他类型水溶性维生素的检测研究均采用高效液相色谱法，但同时分离维生素C、维生素B2、VCP和VB2P的方法还鲜见报道。本研究通过优化色谱分离测定条件，建立了利用高效液相色谱同时分离维生素 C、维生素 B2、VCP和 VB2P的方法，并对其他类型水溶性维生素无明显干扰。该方法可用于测定预混合饲料中维生素 C、维生素 B2、VCP和VB2P的含量。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 Aglient 1100型高效色谱仪配备二极管检测器（美国安捷伦公司）；色谱柱：Zor-bax Eclipse Plus C18（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；维生素 C （含量大于99%）、维生素B2（含量大于98.7%）、三乙胺-维生素C-2-磷酸酯（含量大于99%，Dr.Ehrenstorfer公司）、维生素B2-5-磷酸钠（含量大于93%，购自阿拉丁试剂有限公司）、四丁基硫酸氢铵（Sigma公司）；实验用水为Mili-Q纯化后的超纯水 （＞18 MΩ）；其他试剂均为分析纯；不含上述成分的预混合饲料由北京华罗饲料添加剂厂提供，其他类型预混合饲料从中国市场上收集。

1.2 标准溶液的配制 分别称取三乙胺-维生素C-2-磷酸酯、维生素B2-5-磷酸钠50 mg，置于50 mL容量瓶中，加入1.5 mmol/L四丁基硫酸氢铵缓冲溶液80 mL，超声溶解，用四丁基硫酸氢铵缓冲溶液定容，于0～4℃冰箱保存。称取维生素B225 mg，置于250 mL容量瓶中，加入200 mL水和2 mL冰乙酸，100℃水浴煮沸至完全溶解，冷却，用水定容至刻度，于0～4℃冰箱保存。维生素C现配现用，称取维生素C 100 mg置于100 mL容量瓶中，加四丁基硫酸氢铵缓冲溶液超声溶解，定容至刻度。

将标准贮备液用水稀释成不同浓度的混合标准工作液，现用现配。

1.3 样品前处理 维生素预混合饲料：精密称取0.5～2 g（根据样品中维生素的含量定）置于50 mL塑料管中，加入1.5 mmol/L四丁基硫酸氢铵缓冲溶液20 mL，超声30 min，于5000 r/min离心5 min。取上层溶液。过0.45 μm滤膜，上液相色谱测定。

复合预混合饲料：精密称取2～5 g（根据样品中维生素的含量定）置于50 mL塑料管中，加入约100 mg乙二胺四乙酸钠和1.5 mmol/L四丁基硫酸氢铵缓冲溶液20 mL，超声30 min，于5000 r/min离心5 min。取上层溶液，过0.45 μm滤膜，上液相色谱测定。

液体预混合饲料：根据样品中维生素的含量，稀释处理后上液相色谱测定。

1.4 色谱条件 色谱柱：ZORBAX Eclipse plus C18色谱柱；流动相A：1.5 mmol/L四丁基硫酸氢铵缓冲溶液（用三乙胺和乙酸溶液调节到3.0）；流动相 B：甲醇；流速：1.0 mL/min；梯度淋洗：0 ～ 3 min 2%B；3～9 min 2%B ～40%B；9～15 min 2%B ～40%B；15～20 min 2%B。 柱温：30℃；检测模式：二极管检测，检测波长255 nm。如需单独测定，维生素 C为 243 nm，VCP为 263 nm； 维生素 B2、VB2P为267 nm。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

2.1.1 流动相的选择 海沙尔·吐热别克等（2002）采用离子对试剂（戊烷磷酸钠、己烷磷酸钠和庚烷磷酸钠）分离维生素，但离子对试剂会使维生素C和VCP共流出，无法获得良好的分离效果。成志强等（2001）使用磷酸二氢钾溶液和甲醇，采用梯度淋洗方法有效分离了维生素C和维生素B2等8种水溶性维生素，但是该方法无法有效地分离维生素B2、VB2P，并且在此条件下，VCP与其他维生素同时出峰。为了有效地分离，本实验最终选择氢氧化四丁基铵作为缓冲液进行分离。

2.1.2 氢氧化四丁基铵缓冲溶液浓度、pH对分离效果的影响 将色谱柱温度设定在30℃，流速为1.0 mL/min， 分别以 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mmol/L的氢氧化四丁基铵缓冲溶液与20%甲醇作为淋洗液，考察氢氧化四丁基铵淋洗液浓度变化对维生素C、维生素B2、VCP和VB2P的分离及峰形的影响。结果表明，VCP和VB2P的保留时间随淋洗液中氢氧化四丁基铵浓度的增加而缩短，氢氧化四丁基铵浓度对维生素C、维生素B2的保留时间影响较小。同时，氢氧化四丁基铵淋洗液浓度对VCP的峰形影响很大，淋洗液浓度越高，VCP的峰形越宽，灵敏度变低，对其他物质无明显影响。综合考虑分离度、分离时间、峰形，最终氢氧化四丁基铵的浓度选定为1.5 mmol/L。

同时研究了使用氢氧化四丁基铵缓冲溶液作为流动相情况下，pH值对分离的影响。结果表明，pH值对维生素C和维生素B2保留时间影响较小，而对VCP和VB2P保留时间影响显著。pH值增加时，VCP和VB2P保留时间变长。当pH=3时，4种水溶性维生素的色谱峰保留时间基本稳定，且色谱峰均达较好分离。故确定流动相中氢氧化四丁基铵缓冲液的pH值为3.0。

2.1.3 甲醇对分离效果的影响和梯度选择 研究了氢氧化四丁基铵与甲醇不同组成比例下的洗脱状况，结果表明，甲醇含量的变化对VCP的保留时间无明显影响，但对维生素C、维生素B2、VB2P有较明显的影响；随着甲醇含量的降低，VB2P和维生素B2两组的保留时间延长，而且维生素B2的色谱峰有明显的拖尾，对称性较差。参考4种维生素色谱峰的峰形、与其他维生素分离度和色谱分析时间，确定了流动相的梯度起始和结束时的组成比例以及线性梯度洗脱程序。最佳洗脱梯度见1.4。在此条件下，4种待测物与其他维生素分离良好，具体分离色谱图见图 1。

图1 维生素C、维生素B2、VCP和VB2P与其他水溶性维生素分离色谱图

2.1.4 检测波长的选择 将4种维生素标准分别扫描200～400 nm的吸收光谱，结果维生素B2、VB2P的最大吸收波长均为266 nm；维生素C、VCP为243 nm。为便于同时检测，将检测波长设置在255 nm。如为了获得更好的结果，可将各种待测物分别采用其最大波长进行检测。

2.2 提取剂及提取方法的选择 维生素易溶于水，常温下比较稳定，用水提取即可有较好的回收率，但为了保证与流动相一致，采用1.5 mmol/L四丁基硫酸氢铵缓冲溶液作提取溶剂。复合预混合饲料含有大量的金属离子，在处理过程中，加入乙二胺四乙酸（EDTA）作为掩蔽剂，可以有效地消除金属离子干扰，提高检测结果的可靠性。确定了提取溶剂后，实验比较振荡提取和超声波提取对其的提取效率，结果两种提取方法无明显差异。为了节约时间，最终选用超声处理。

液体预混合饲料成分较为简单，可以直接稀释处理后上机测定。

2.3 方法性能

2.3.1 线性方程与检测限、定量限 用储备液配制浓度为1～100 mg/L标准溶液，进液相色谱检测，以峰面积与标准溶液终浓度作标准曲线。线性方程相关系数见表1。可见标准溶液在1～100 mg/L内线性关系良好。

选择空白的预混合饲料样品，以依次递减的方式添加标准溶液标样，经提取、净化步骤后进行仪器分离测定，根据3倍噪音的峰响应值得出方法的检测限。根据10倍噪音的峰响应值，确定定量限。结果见表1。

表1 方法的线性范围、标准曲线、检出限及定量限

2.3.2 回收率与精密度 为了考查方法，精密称取2 g空白维生素预混合饲料和5 g空白复合预混合饲料样品，加入不同浓度的标准溶液。按上述实验方法测定，每个样品6个重复。回收率和精密度测定结果见表2。由表2可知，各种维生素回收率均大于80%，相对标准偏差为 2.0%～9.6%，证明该方法适用于预混合饲料中维生素C、维生素B2、VCP和VB2P含量的测定。

表2 不同预混合饲料的添加回收率（n=6）%

2.3.3 实际样品检测 应用该方法对从市场上采集到的20份不同预混合饲料进行了检测，检测结果见表3。其中某些只添加VCP和VB2P的预混合饲料中也检测出了维生素C和维生素B2，主要原因是添加在预混合饲料中的VCP和VB2P原料在合成过程中存在残留的副产物（维生素C和维生素B2）。部分预混合饲料测定结果比标示值高，尤其是维生素C，其原因是生产厂家为了保证产品的质量，考虑到维生素的稳定性，一般会在生产过程中过量添加。

表3 实际样品检测结果

3 结论

本研究建立了利用高效液相色谱同时分离维生素 C、维生素B2、VCP和 VB2P的方法，并对其他水溶性维生素无明显干扰。具有简单、快速、准确、分离效果好和一次处理同时分析多种水溶性维生素的特点。适合于预混合饲料中维生素C、维生素B2、VCP和VB2P含量的测定。

[1]陈丽，孙宏民.维生素在饲料加工中的应用[J].农产品加工，2004，12：32～ 33.

[2]海沙尔·吐热别克，塔依尔·斯马依.离子对试剂用于4种水溶性维生素的液相色谱分离[J].分析化学，2002，30（7）：896 ～ 896.

[3]贾彤，陈冰.婴幼儿配方奶粉中核黄素磷酸钠的测定[J].中国乳品工业2009，37（10）：59 ～ 60.

[4]Powers H J.Riboflavin and health[J].Am J Clin Nutr，2003，77：1352 ～ 1360.

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