秦皮甲素通过抑制Ras/ERK通路诱导人肺癌细胞A549凋亡

王 晶

（辽宁医学院附属第一医院，辽宁　锦州　121000）

秦皮甲素通过抑制Ras/ERK通路诱导人肺癌细胞A549凋亡

王 晶

（辽宁医学院附属第一医院，辽宁锦州121000）

目的 探讨秦皮甲素通过抑制Ras/ERK通路诱导人肺癌细胞A549凋亡的作用。方法 MTT法检测肺癌细胞A549的增殖，流式细胞仪检测细胞凋亡，分光光度法检测半胱氨酸蛋白酶caspase3、8、9的活性，免疫印迹法检测K-Ras、细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）、磷酸化细胞外信号调节激酶1/2（p-ERK1/2）蛋白表达的变化。结果秦皮甲素可抑制人肺癌细胞A549的增殖，IC50值为0.4 mmo1/L，并诱导凋亡；caspase3和caspase9表达增强，caspase8表达无明显改变。p-ERK1/2和K-Ras蛋白表达减弱，而ERK1/2蛋白表达无明显变化。结论 秦皮甲素通过显著抑制K-Ras的表达和ERK1/2的磷酸化水平诱导人肺癌细胞A549凋亡。

秦皮甲素；人肺癌细胞A549；Ras/ERK通路；凋亡

秦皮始载于《神农本草经》，列为中品，秦皮甲素是中药秦皮中发挥药理作用的主要有效成分［1］，现在中药有效成分的临床应用已经成为中医药发展的重要内容。秦皮药材资源丰富，价格低廉，秦皮甲素是中药秦皮中含有量最高的成分（1.436%～3.043%）。前期的研究显示，秦皮甲素可以诱导人肺癌细胞H-125的凋亡［2］，但是对其具体作用机制并未进行深入探讨；而且秦皮甲素对人肺癌细胞A549的作用并未进行研究。因此本实验拟研究秦皮甲素对人肺癌细胞A549增殖、凋亡的作用并对其具体作用机制进行深入探讨，为秦皮甲素的临床应用提供理论依据与实验基础。

1　实验材料

1.1细胞株 人肺癌细胞A549购于中国医科大学。

1.2药物 秦皮甲素（中国食品药品检定研究院，批号110740-200104）。兔抗人K-Ras、ERK1/ 2、p-ERK1/2一抗（Ce11Signa1ing公司），鼠抗兔二抗（北京博奥森生物技术公司）。

1.3试剂 MTT（Sigma公司）；Annexin-PI凋亡检测试剂盒（北京宝赛生物有限公司）；caspase-3，caspase-8，caspase-9活性检测试剂盒（碧云天生物技术研究所）；胰蛋白酶（Hyc1one公司）；小牛血清（杭州四季清生物制品公司）；RPML-1640培养基（南京凯基公司）。其他试剂为国产分析纯。

1.4仪器 荧光显微镜（LEICACTR4000，德国），XD-101型倒置显微镜（OLYMPUS TOKYO JAPAN）；流式细胞仪（BD FACSCaLibur）；凝胶成像仪（美国BIORAD）；超净工作台（江苏吴县市净化技术研究所）；二氧化碳培养箱（She1don Manufacturing IncUSA）；酶标仪（9602A北京普朗）。

2　实验方法

2.1细胞培养 人肺癌细胞A549用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液，在37℃，5%CO2细胞培养箱中进行培养。每两天换液1次，待细胞长至对数生长期时进行试验。

2.2MTT法检测细胞增殖抑制率 取对数生长期肺癌细胞，用0.25%胰酶消化，计数，以5× 103～10×103个/孔接种于96孔板中。待细胞贴壁生长后，将细胞分为阴性对照组、阳性对照组（5-Fu 0.77 mmo1/L）、秦皮甲素处理组（秦皮甲素0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mmo1/L），每孔200 μL。细胞培养箱中培养48 h后终止反应，每孔加入MTT 20μL，继续培养4 h。用翻板法将上清弃去，每孔加入DMSO 150μL，在摇床上振动混匀10 min。在酶标仪上490 nm波长处检测各孔吸光度（A）值。抑制率（%）=（1-实验组A值/对照孔A值）×100%。实验重复3次，计算平均抑制率。

2.3Annexin V-FITC/PI双染色法检测细胞凋亡

取人肺癌细胞A549按4×104个/mL接种于25 mL培养瓶中，待细胞长至对数生长期时，将细胞分为阴性对照组、阳性对照组（5-Fu 0.77 mmo1/L）、秦皮甲素处理组（秦皮甲素0.4、0.8、1.6 mmo1/L）。继续培养48 h后，取出细胞，用0.25%胰酶消化，5 mL PBS洗细胞两次，800×g离心5 min，收集细胞至检测管内。采用Annexin V-FITC染色，加入10μL AnnexinV-FITC和5μLPI，轻轻混匀，在1 h内用流式细胞仪进行测定。数据经Bioconsort专用软件处理，分析细胞凋亡率。

2.4分光光度法检测半胱氨酸蛋白酶caspase3、8、9的活性 细胞分组、处理同“2.3”项。然后按照试剂盒的说明进行操作。600×g 4℃离心5 min，收集细胞，小心吸除上清，PBS洗涤1次。每个样品均加入裂解液150μL，重悬沉淀，冰浴裂解细胞15 min，然后16 000×g 4℃离心15 min，将上清小心转移至冰浴预冷的空白EP管中。96孔板中每孔依次加入检测缓冲液60μL，待测样品30 μL，底物Ac-IETD-ρNA 10μL，小心混匀。37℃避光孵育6 h，405 nm处测定样品吸光值，样品吸光值减去对照组吸光值即为样品中caspase催化产生ρNA的吸光度值。再通过标准曲线计算，即可反映caspase酶活性的大小。结果用试验组A405值/对照组A405值的比值来表示。

2.5免疫印迹法检测ERK1/2，p-ERK，K-Ras蛋白表达的变化 细胞分组、处理同“2.3”项。然后一步法裂解细胞，在4℃时12 500 r/min离心5 min，取上清液进行蛋白浓度的测定。用10%SDSPAGE分离蛋白，电泳后将蛋白转至硝酸纤维素膜上。加入1∶1 000稀释一抗，4℃过夜，洗膜。再加入1∶1 000稀释的二抗室温孵育1 h，洗膜4次，每次15 min。最后显色，照相。

2.6统计学处理 用SPSS 17.0统计软件进行分析，计量资料以±s表示，P＜0.05为差异具有统计学意义。

3　结果

3.1秦皮甲素对人肺癌细胞增殖的影响 秦皮甲素作用于人肺癌A549细胞48 h后，显著抑制肺癌细胞的增殖。并且随着秦皮甲素浓度的升高，抑制率也明显增大。秦皮甲素的IC50值为0.4 mmo1/L。结果见表1。

表1　秦皮甲素对人肺癌细胞A549增殖的影响（±s，n=5）Tab.1 Effects of escu Iin on the proIiferation of A549 human Iung cancer（±s，n=5）

表1　秦皮甲素对人肺癌细胞A549增殖的影响（±s，n=5）Tab.1 Effects of escu Iin on the proIiferation of A549 human Iung cancer（±s，n=5）

注：与阴性对照组比较，★★P＜0.01

组 别检测浓度/（mmo1·L-1）吸光度值抑制率/ % 0 0.872±0.19 0阳性对照组（5-Fu）0.77 0.312±0.13★★64.2秦皮甲素组0.1 0.559±0.20★★35.9秦皮甲素组0.2 0.470±0.17★★46.1秦皮甲素组0.4 0.436±0.25★★50秦皮甲素组0.8 0.301±0.23★★65.4秦皮甲素组1.6 0.246±0.15★★阴性对照组71.8

3.2秦皮甲素对人肺癌细胞凋亡的影响 应用Annexin V-FITC和PI双染法检测凋亡，Annexin V可与凋亡早期翻转到膜外的磷脂酰丝氨酸特异性结合。PI能够透过凋亡中、晚期细胞和死细胞的细胞膜而使细胞核红染。因此Annexin V与PI合用，可以将凋亡早期和晚期的细胞以及死细胞区分开。秦皮甲素作用于人肺癌A549细胞48 h后，随着秦皮甲素浓度的升高，凋亡现象明显，结果见图1。

图1　秦皮甲素对人肺癌细胞A549凋亡的影响Fig.1　Effects of escu Iin on apop tosis in human Iung cancer A549

3.3秦皮甲素对人肺癌A549细胞caspase3、8、9表达的影响 由表2可见，秦皮甲素作用于人肺癌A549细胞后，caspase3和caspase9的表达随秦皮甲素浓度的升高而增强，caspase8的表达无明显改变。

表2　秦皮甲素对人肺癌细胞A549caspase3、8、9表达的影响（±s，n=5）Tab.2 Effects of escu Iin on caspase3，8，9 activity in human Iung cancer A549（±s，n=5）

表2　秦皮甲素对人肺癌细胞A549caspase3、8、9表达的影响（±s，n=5）Tab.2 Effects of escu Iin on caspase3，8，9 activity in human Iung cancer A549（±s，n=5）

注：与阴性对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

1.0 1.0 1.0 5-Fu 0.77 mmo1/L 1.37±0.25*1.58±0.08*1.03±0.22*秦皮甲素0.4 mmo1/L 1.16±0.09*1.24±0.14*0.99±0.10*秦皮甲素0.8 mmo1/L 1.34±0.12*1.63±0.21*1.08±0.05*秦皮甲素1.6 mmo1/L 1.79±0.30**2.05±0.18*1.05±0.20 caspase3 caspase9 caspase8阴性对照组组 别*

3.4秦皮甲素对人肺癌细胞ERK1/2，p-ERK1/2，K-Ras蛋白表达的影响 秦皮甲素作用于人肺癌A549细胞48 h后，K-Ras蛋白的表达减弱，ERK1/2蛋白的表达无明显改变，p-ERK1/2蛋白的表达明显降低，见图2。结果显示，秦皮甲素可以显著抑制K-Ras的表达和ERK1/2的磷酸化水平。

4　讨论

秦皮甲素是中药秦皮中的主要有效成分，具有抗炎镇痛、抗病原微生物、抗病毒、抗氧化等作用。近几年研究发现秦皮甲素在体内外均显示抗肿瘤和免疫调节作用。可抑制化学致癌物1，2-二甲肼诱导的大鼠结肠DNA氧化损伤和肿瘤生长［1］。

细胞凋亡又称为程序性细胞死亡，目前已知两种信号途径可以诱导细胞凋亡的发生，即外源性途径作用于半胱氨酸蛋白酶caspase8；内源性途径作用于半胱氨酸蛋白酶caspase9，二者最终都活化下游caspase3，诱导细胞凋亡［3-8］。实验发现，随着秦皮甲素浓度升高，细胞凋亡率增大的同时可使半胱氨酸蛋白酶caspase9、caspase3活性增强，而对caspase8的活性没有影响。由此可见，秦皮甲素可以通过内源性途径诱导细胞凋亡。因为在细胞凋亡过程中ERK通路发挥着重要的作用，因此本实验进一步研究了秦皮甲素是否参与了ERK信号通路的调节作用。

图2　秦皮甲素对人肺癌细胞ERK1/2，p-ERK 1/2，K-Ras蛋白表达的影响Fig.2　Effects of escu Iin on expressions of protein ERK 1/2，p-ERK1/2，K-Ras in human Iung cancer ceIIA549

Ras/Raf/MEK/ERK是ERK通路的主要途径，K-Ras蛋白是人类肿瘤中最常见的突变类型，ERK1/2是其下游信号分子。ERK1/2是决定细胞命运的关键分子，决定着细胞的分裂增殖、终末分化或进入凋亡程序。ERK1/2激活后进入细胞核内，可激活或灭活其他信号转导途径的关键效应分子，调节相应靶基因转录，引起特定蛋白的表达或活性改变，最终促进细胞增殖和恶性转化，阻止细胞凋亡，同时产生多种细胞因子，刺激细胞生长［9-11］。

本实验通过细胞免疫印迹试验发现，秦皮甲素作用于人肺癌A549细胞48 h后，可显著抑制KRas的表达和ERK1/2的磷酸化水平。结果显示秦皮甲素可通过抑制K-Ras及其下游信号分子的活化而诱导细胞凋亡。ERK信号通路作为一条将细胞外信息向细胞核传递的通路，在细胞增殖和凋亡过程中都发挥着重要的调节作用［12-13］，因此有可能成为治疗肺癌的新靶点。

综上所述，秦皮甲素可以抑制人肺癌细胞A549的增殖，并通过内源性途径诱导凋亡。但是，秦皮甲素在诱导细胞凋亡的过程中还有哪些信号分子参与其中，是否影响肿瘤血管的形成等等，这些作用机制尚需进行深入研究。

［1］方莲花，吕 扬，杜冠华.秦皮的药理作用研究进展［J］.中国中药杂志，2008，33（23）：2732-2736.

［2］王 晶.秦皮甲素对人肺癌细胞H-125体外增殖的影响［J］.时珍国医国药，2011，22（2）：507-509.

［3］宋少华，郭闻渊，傅志仁，等.丹参多酚酸盐通过线粒体途径诱导人肝癌SMMC-7721细胞的凋亡［J］.中国肿瘤生物治疗杂志，2010，17（1）：62-66.

［4］李俊峰，邓永东，张立婷，等.Ras/Erk信号转导通路在肝纤维化发生发展中的作用［J］.临床肝胆病杂志，2011，27（3）：325-327.

［5］王启章，郭 毅，韩利民，等.小檗碱通过ERK，JNK信号转导途径对COX-2的抑制作用［J］.第四军医大学学报，2009，30（24）：2935-2939.

［6］黄 坊，谢 明，景志亮，等.ERK/MAPK信号通路活性表达与鼻咽癌细胞增殖凋亡的关系［J］.中华肿瘤防治杂志，2010，17（15）：1192-1195.

［7］赵俊霞，闫永鑫，王彦玲，等.刺五加多糖通过ERK信号转导途径诱导H446细胞G2/M期阻滞［J］.基础医学与临床，2010，30（1）：59-62.

［8］黄震洲，陈美娟，熊 飞，等.周氏克金岩方有效成分槲皮素促进肺癌细胞NCI-H460凋亡的相关机制研究［J］.南京中医药大学学报，2012，28（3）：235-237.

［9］孙晓东，刘杏娥.姜黄素通过抑制Ras-ERK和Shh-GL11信号诱导胰腺癌细胞凋亡［J］.中国病理生理杂志，2012，28（6）：996-1000.

［10］王新国，张思泉，刘华锋.硫化氢对再生肝细胞Ras-ERK通路活化的影响［J］.浙江实用医学，2012，17（4）：248-271.

［11］王建竹，连金饶，孔祥英，等.雷公藤甲素对TNF-α诱导的滑膜细胞增殖的影响及对Ras-MAPKs信号转导通路的调控作用［J］.中国中药杂志，2010，35（7）：888-891.

［12］刘立群，郭 微，余文丹，等.漆黄素通过调节Apaf-1，ERK和COX-2信号通路诱导人宫颈癌细胞凋亡［J］.中山大学学报：医学科学版，2013，34（1）：75-82.

［13］张丽志，翟全新，温 克.ERK信号转导通路对肿瘤细胞生物学行为的调控［J］.医学综述，2011，17（6）：836-838.

Escu Iin induces A549 Iung cancer ceIIapoptosis by inhibiting Ras/ERK pathway

WANG Jing
（First Affiliated Hospital of Liaoning Medical University，Jinzhou 121000，China）

AIM To exp1ore the escu1in's possib1e effect of inducing apoptosis of A549 1ung cancer ce11 through inhibiting the Ras/ERK pathway.METHODS A549 1ung cancer ce11pro1iferation wasmeasured by MTT method，ce11apoptosiswas detected by f1ow cytometry，the activities of cysteine protease caspase-3，8，9 were determined by spectrophotometric method.The protein expression changes of K-Ras，extrace11u1ar signa1 regu1ating kinase1/2（ERK1/2），phosphory1ated ERK1/2（p-ERK1/2）were determined by Western-b1ot.RESULTS Escu1in inhibited the pro1iferation of human A549 1ung cancer ce11s and induced its apoptosis with a IC50of 0.4 mmo1/L，and the activities of caspase-3，caspase-9 increased whi1e caspase-8 did not show any significant change. Protein expression of p-ERK and K-Ras decreased and ERK1/2 remained the same.CONCLUSION The data demonstrats that escu1in-induced apoptosis in A549 1ung cancer ce11 is performed by inhibiting the Ras protein expression and ERK phosphory1ation.

escu1in；A549 1ung cancer ce11；Ras/ERK pathway；apoptosis

R966

A

1001-1528（2015）01-0040-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.01.007

2014-02-15

辽宁省自然科学基金项目（2013022063）

王 晶（1974—），女，主管药师，研究方向：中药抗肿瘤药理。Te1：15004162307，E-mai1：wangjing2006050@126.com