血管生成素-2与大肠癌淋巴管密度的相关性研究

谭风波 喻南慧 徐海帆★

血管生成素-2与大肠癌淋巴管密度的相关性研究

谭风波 喻南慧 徐海帆★

目的 通过检测大肠癌标本的血管生成素-2（ANG-2）mRNA的表达，并进行微淋巴管计数，探讨ANG-2 mRNA的表达与微淋巴管密度（MLVD）的关系，推断其在大肠癌微淋巴管生成中的作用。方法 应用RT-PCR检测癌组织、良性病变及手术切缘正常组织的ANG-2 mRNA的表达；应用免疫组化技术，以LYVE-1标记微淋巴管并计数。结果 ANG-2 mRNA在癌组织内阳性表达64.0%，良性病变内阳性表达8.3%，手术切缘正常组织内阳性表达7.5%。ANG-2 mRNA表达阳性的癌旁MLVD比阴性高（P＜0.01），且ANG-2 mRNA的表达水平与癌旁MLVD存在相关性（P＜0.05，r=0.493）。癌旁MLVD及手术切缘正常组织MLVD比癌组织高（P＜0.01），且癌旁MLVD比手术切缘正常组织MLVD高（P＜0.01）。Duke's A、B期的癌旁MLVD较C、D期低；有淋巴结转移的癌旁MLVD比无淋巴结转移的癌旁MLVD高（P＜0.05）。结论 ANG-2 mRNA在大肠腺癌组织内有高表达并与癌旁MLVD的表达水平密切相关。

大肠腺癌 血管生成 淋巴管生成 血管生成素-2

大肠癌是消化道常见的恶性肿瘤，淋巴道转移是影响大肠癌疗效和预后的主要因素之一。肿瘤淋巴道转移需通过新生淋巴管，因此研究肿瘤淋巴管生成有利于找到对应的靶向治疗目标，为大肠癌防治提供临床指导。近期研究发现血管生成素-2（ANG-2）/ Tie-2系统对淋巴管的发育和生长也有重要影响，但ANG-2的高表达是否促使各类肿瘤的淋巴结转移尚存在很大的争议，特别在大肠腺癌研究中，缺少对ANG-2与肿瘤微淋巴管密度的定量相关性分析。

1　临床资料

1.1一般资料 选择2009年7月至2009年11月南华大学附属第一医院经外科手术获取的大肠癌标本50例，其中男28例，女22例；年龄35～81岁，中位年龄57.2岁。所有患者术前均未行化疗及放疗，均获患者知情同意，且临床资料完整。所获标本：切取大小0.5cm×0.5cm×0.5cm的癌组织、正常肠壁黏膜组织，分别置入液氮、福尔马林液体。结合术后病理科诊断以核实取材正确并诊断分期。病理组织学分型包括高-中分化腺癌17例，黏液腺癌及印戒细胞癌统称为差分化腺癌、低分化腺癌33例；Duke's期A～B期27例、Duke'sC～D期23例，诊断标准按照我国结直肠癌协作组制定的结直肠癌临床病理分期标准。另收集南华大学附属第一医院大肠良性病变12例为对照组，男5例，女7例；年龄8～67岁，平均年龄（50.3±0.12）岁。

1.2主要试剂及方法 鼠抗人CD34单克隆抗体、通用型二氨基联苯胺/DAB染色试剂盒及SP Kit广谱免疫组化试剂盒购自北京博奥森生物技术有限公司。鼠抗人LYVE-1单克隆抗体购自福州迈新生物技术有限公司。MarkerⅡ、2×Taq PCR MasterMix 、TRIzol 及Reverse Transcription System购自上海生工生物工程有限公司。（1）RT-PCR检测ANG-2 mRNA的表达：引物由上海生工生物工程有限公司合成（ANG-2，上游引物：5'-TTGGAACACTCCCTCT-3'； 下游引物：5'-TCACGT CGCTGAATAA-3'扩增片段506bp。β-actin，上游5'-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3'；下游：5'-CTCCTTAATGTCACGCACGATTT-3'扩增片段317bp）。先行RNA的提取，再进行逆转录及聚合酶链反应，取逆转录反应产物1μl、2×PCR Buffer 10μl、上游引物和下游引物各1μl、超纯水7μl。进行热循环，具体反应条件如下：（94℃，2min）1Cycle；（94℃，30s），（48℃，30s），（72℃，45s）35 Cycles；（72℃，5min）1Cycle；4℃保存，电泳，紫外透视分光仪摄片，经凝胶密度扫描系统处理，测定灰度值。计算ANG-2条带与β-actin条带灰度值比。（2）免疫组化：对50例结肠癌的病理蜡块，制作石蜡切片，厚4μm，用3% H2O2灭活内源性过氧化物酶10min，PBS（pH7. 4）水洗。然后分别与一抗（鼠抗人CD34、LYVE-1，1∶200稀释），二抗及过氧化物酶标记的链霉素亲和素抗体孵育，以PBS代替一抗作为阴性对照。PBS水洗后DAB显色15 min，苏木素复染，封片观察。

1.3微淋巴管判定与计数 由两位病理科医师分别进行双盲阅片，显微镜下LYVE-1+/CD34-内皮细胞定义为微淋巴管。微淋巴管密度（MLVD）的结果判定如下：在低倍镜（×100倍）下寻找LYVE-1阳性脉管密集区，换高倍镜（×400倍）选取3个视野计数，取其平均值计算MLVD。

1.4统计学处理 采用SPSS16.0软件。采用卡方检验、两独立样本的t检验、直线回归分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1ANG-2 mRNA的表达情况 见表1、图1。

表1　不同组织中ANG-2 mRNA的表达比较［n（%）］

2.2各组中MLVD的表达情况与及MLVD与大肠腺癌的临床病理的关系 见表2、3。

表2　不同组织中MLVD的的表达情况

表2　不同组织中MLVD的的表达情况

分组nMLVD癌组织503.17±2.51良性病变126.32±1.96手术切缘正常组织507.69±1.87

表3　MLVD与大肠腺癌的临床病理关系

表3　MLVD与大肠腺癌的临床病理关系

MLVDt值P值Duke's分期3.47＜0.01 A/B276.40±2.15 C/D238.98±2.95分化程度2.06＜0.05差/低338.23±3.14高/中176.45±2.30淋巴结转移2.05＜0.05无156.04±4.46有358.42±3.38远处转移0.15＞0.05无387.62±4.67有127.86±5.51性别0.12＞0.05男287.74±2.53女227.63±3.56年龄0.29＞0.05≤50岁197.49±3.05＞50岁317.82±4.19 n

2.3免疫组化 各组微血管密度（MVD）及MLVD的染色情况。见图2。

图1　ANG-2 mRNA表达

图2　各组免疫组化MVD及MLVD的染色

2.4ANG-2 mRNA的表达与MLVD的关系 50例大肠腺癌组织中，32例ANG-2 mRNA阳性表达的癌旁MLVD高于18例ANG-2 mRNA阴性组，两组比较差异有统计学意义（P＜0.05）见表4。32例ANG-2 mRNA阳性表达组中，ANG-2 mRNA的表达量与癌旁MLVD成正相关性（P=0.002，r=0.493）。见图3。

图3　ANG-2 mRNA的表达量与癌旁MLVD之间回归性分析

表4　ANG-2 mRNA的表达与癌内MVD及癌旁MLVD之间的关系

3　讨论

血管生成素家族（ANGs）是1996 年发现的一族蛋白分子，包括ANG-1、 ANG-2、 ANG-3 及 ANG-4共4种分子［1］，其作用各异。ANG-1和ANG-2是目前研究较广泛且功能较明确，二者共同的受体Tie2属于受体酪氨酸激酶（RTK）家族成员。

ANG-2在淋巴管生成中的作用近几年才有报道，研究发现 ANG-2/Tie2 系统对淋巴管的发育和生长也有重要影响，ANG-2与Tie2在LECS（淋巴管内皮细胞）中的协同表达提示ANG-2在淋巴管生成中的作用［2，3］。剔除ANG-2基因的小鼠发生淋巴管发育与功能缺陷，出现乳糜腹水，表明 ANG-2 对于正常淋巴管的形成和稳定是必需的［4］。Kim KE［5］等通过兔耳及气道损伤模型首次发现血管生成素家族能促进淋巴管生成。亦有报道，ANG-1/ANG-2均能与肠系膜的LECS的Tie2结合并使其磷酸化，ANG-2催进LECS增殖作用较ANG-1强，而ANG-1促迁移作用更显著［6］。

随着一些淋巴管内皮细胞标记物陆续被发现，其中具有代表性的有血管内皮生长因子-C（VEGF-C）、血管内皮生长因子-D（VEGF-D）、 血管内 皮 生 长 因子 受 体 3（VEGFR-3）、LYVE-1、 Podoplanin、Prox-1等，为淋巴管的研究提供了可靠的实验方法［7］。本资料中，连续切片的同一视野下，未发现LYVE-1和CD34均为阳性的管腔，LYVE-1阳性管腔中未发现红细胞，表明LVYE-1用于大肠癌的肿瘤微淋巴管标记行MLVD计数是切实可行的。作者通过免疫组化标记淋巴管内皮细胞经显微观察发现，大肠癌新生微淋巴管主要集中于癌旁区，癌内中央区则最稀疏。癌旁微淋巴管多扩张明显，未见完整的管腔，有开放腔面，周围大量淋巴细胞浸润。中央区则多呈闭锁状或条索状，甚至完全缺如，部分为单个着色的淋巴内皮细胞，表明癌旁淋巴管不仅数量且形态功能上更有利于肿瘤细胞的转移。有文献报道［8，9］，出现癌旁区、 癌内中央区微淋巴管分布及形态的差异可能是由于肿瘤细胞在中央区增殖产生的高压不利于微淋巴管生成。即使有微淋巴管生成，也因易受压而变细、 塌陷、 萎缩或因肿瘤细胞入侵，淋巴管结构被破坏，从而处于无功能状态。而在前缘区，肿瘤组织间压力较低，有利于微淋巴管的形成而成为真正有功能的淋巴管。分析本实验结果得出癌旁MLVD与大肠腺癌的临床病理参数的关系显示癌旁MLVD与大肠腺癌的组织学分化程度、Duke's分期及淋巴结转移相关，而MLVD与远处转移、性别及年龄并无明显关系，因而可以推断大肠癌的癌旁MLVD可作为指导术后治疗及预后的一个可靠因素，区域淋巴系统有抗肿瘤远处转移的作用。

目前关于ANG-2能否促进肿瘤微淋巴管生成的研究较少。在乳腺癌体外培养实验中证明ANG-2上调特异的淋巴管生成因子之一VEGFR-3的表达而间接达到促进肿瘤新生淋巴管形成的作用，同时通过利用可溶性Tie2结合ANG-2使淋巴管内皮细胞的增殖率减少50%［10］。少部分国内外的研究报道，ANG-2较ANG-1与肿瘤的淋巴结的转移关系密切［11］，但ANG-2的高表达是否促使各类肿瘤的淋巴结转移研究结果不尽一致［12］。本资料显示ANG-2 mRNA的表达量及MLVD成正相关性，从而推断ANG-2在大肠腺癌内高或过表达对大肠腺癌中微淋巴管的生成可能起促进作用，进而为肿瘤细胞沿新生的淋巴管迁徙和转移提供途径，是促使肿瘤淋巴管转移的一个重要因子。

综上所述，大肠癌淋巴管生过程中ANG-2具有的重要作用，但要明确ANG-2作用的具体调控机制及影响因素，仍需要通过建立大肠癌动物模型，进行体内外实验来进一步验证。通过动物实验积极寻找阻断ANG-2作用途径的靶点，将成为拮抗大肠癌微淋巴管生成的一个新方向。

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6 Fagiani E， Lorentz P， Kopfstein L， et al. Angiopoietin-1 and -2 exert antagonistic functions in tumor angiogenesis， yet both induce lymphangiogenesis .Cancer Res，2011，71（17）：5717～27.

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Objective Expression of angiopoietin-2mRNA was detected and microlymphatic vessel density（MLVD）was counted in CRC，then investigated correlation of the expression of ANG-2mRNA with MLVD in order to deduce relation of ANG-2 with lymphangiogenesis in CRC indirectly. Methods RT-PCR was applied to detect expression level of ANG-2mRNA in cancer tissue，benign tissue and normal surgical margin tissue，and MLVD marked by LYVE-1 was counted by morphometric. Results （1）In all samples，positive rates of ANG-2mRNA in CRC's cancer tissue，benign tissue and normal surgical margin tissue were（32/50），（1/12）and（3/50）respectively.（2）There were 32 samples that ANG-2mRNA were positive，and among these samples peritumoral MLVD was higher than that in negative group（P＜0.01）；there were a correlation between ANG-2mRNA expression level and peritumoral MLVD（P＜0.05，r=0.493）.（4）MLVD of peritumoral and normal surgeral margin's were higher than intratumoral MLVD（P＜0.01），peritumoral MLVD was higher than normal surgeral margin's MLVD additional（P＜0.01）.（5）level of peritumoral MLVD in Duke's A-B stages was lower than C-D stages of CRC（P＜0.05）；MLVD with lymphatic metastasis was higher than without lymphatic metastasis（P＜0.05）.Conclusions ANG-2 was high expressed in CRC，ANG-2 expression levels have closely relation with peritumoral MLVD.

Colorectal-cancer Angiogenesis Lymphangiogenesis A ngiopoietin-2

421001南华大学附属第一医院肿瘤外科（谭风波 徐海帆）410007长沙市妇幼保健院（喻南慧）