固相萃取-高效液相色谱法测定龙血竭含片中的龙血素A和B的含量

胡旭佳， 杨 娟

(昆明理工大学生命科学与技术学院，云南昆明 650504)

龙血竭为龙舌兰科植物剑叶龙血树(Dracaenacochinchinensis(Lour.)S.C.Chen)含脂木质部经提取加工制成的树脂，常称为“龙血竭”或“国产血竭“，它具有活血散瘀、消炎止痛、收敛止血、生肌敛疮和补血益气等功效，用于跌打损伤、淤血作痛、妇女气血凝滞和外伤出血等的治疗[1,2]，但在临床上一直把龙血竭作为一种配方辅佐。近年来，随着中药剂型的不断发展，其主要剂型为散剂、片剂、胶囊剂和滴丸等。龙血素A(Loureirin A)、B(Loureirin B)为其主要活性成分。目前文献中关于龙血竭原药材、胶囊、滴丸与片剂中龙血素A、B含量的测定已有一些报道，其主要检测方法是毛细管电泳(CE)法和高效液相色谱(HPLC)法[3 - 10]，而关于龙血竭含片中的有效活性成分龙血素A、B含量的测定方法还未见报道。

本实验采用固相小柱经净化富集有效成分后，再通过HPLC法同时测定龙血竭含片中龙血素A、B的含量。该方法简便、准确且重现性好，可为龙血竭含片的质量控制方法的研究提供依据。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

LC-20A高效液相色谱仪(日本，岛津公司)；Tu-1901紫外分光光度计(北京普析通用仪器公司)；CX250超声波清洗器(北京医疗设备二厂)；C18固相萃取填料。

龙血素A对照品(中国药品生物制品检定所，批号：111660-200402，供含量测定用)，龙血素B对照品(中国药品生物制品检定所，批号：111558-200405供含量测定用)。取龙血素A、B对照品适量，精密称定，加甲醇配制成含龙血素A 80 μg/mL和龙血素B 60 μg/mL的溶液，作为对照品溶液。乙腈(色谱纯，德国Merck公司)；其他试剂均为分析纯，购于北京化学试剂厂。水为纯净水(杭州娃哈哈集团)。

龙血竭含片(批号：091001，091002，091101，091102，091201，091202，100101,100102，100201，100202)均由云南大唐汉方制药公司提供。

1.2 样品前处理

取适量龙血竭含片，研细，混匀，按照如下步骤制备样品溶液。

1.2.1提取精密称定研磨好的龙血竭含片粉末0.25 g，置于具塞锥形瓶中，精密加入50 mL 50%甲醇水溶液，盖紧瓶塞，称定重量，超声处理(功率250 W，频率50 Hz)30 min，放冷，再称定重量，摇匀，过滤，弃去初滤液，取续滤液，得样品提取液，待净化。

1.2.2样品的净化固相萃取柱的制备：在10 mL固相萃取空柱管装入3 g C18(200目)材料，轻轻敲打使填料均匀填充，其上下方均用压实的脱脂纱布塞住。固相萃取步骤：使用前先用10 mL甲醇和10 mL水活化小柱，样品液转移入固相萃取柱，控制流速为1滴/秒过柱，最后用1 mL甲醇-水(90∶10，V/V)洗脱，接收液经0.22 μm有机滤膜过滤，以备测定。

1.3 色谱条件

色谱柱：依利特 kromasil C18(200×4.6 mm,5 μm)，流动相：乙腈-0.1%乙酸溶液(37∶63，V/V)为流动相；检测波长：280 nm；进样量：10 μL。

2 结果与讨论

2.1 提取液的选择

实验对提取方法进行了研究，在实验中将同一供试品(云河药业,批号：091001)分别用三氯甲烷、乙酸乙脂、乙腈-乙酸溶液(39∶61，V/V)和甲醇超声提取。经比较发现三氯甲烷和乙酸乙脂超声提取不完全，乙腈-乙酸溶液(39∶61，V/V)和甲醇超声提取结果相近，为操作方便，故选择甲醇超声提取。

2.2 超声时间的选择

同一批号样品(云河药业,批号：091001)以甲醇为提取溶剂，比较10、20、30、40、60、90和120 min等不同超声时间的提取率。结果表明，提取30 min龙血素B提取率最高，龙血素A也基本提取完全，因此本实验选择甲醇超声提取30 min。

2.3 色谱条件的优化

在其他条件不变的情况下，考察了依利特 kromasil C18(200×4.6 mm,5 μm)、汉邦 C18和Agilent C18(Zorbax Exlipse)(150×4.6 mm,5 μm)三种不同品牌的同类型色谱柱对测定结果的影响。实验结果表明，采用以上三种色谱柱，样品都可达到基线分离，不同品牌的同类型色谱柱，对被测成分色谱峰的分离度及测定结果无明显影响。在其他条件不变的情况下，考察了流速对测定结果的影响，结果表明流速分别为0.9、1.0和1.2 mL/min时对被测成分色谱峰的分离度及测定结果无明显影响。在其他条件不变的情况下，考察了柱温对测定结果的影响，实验结果表明，柱温分别为25 ℃、30 ℃和40 ℃时，对被测成分色谱峰的分离度及测定结果无明显影响。优化后的色谱条件见1.3节。

2.4 系统适应性

按照上述优化条件，选用kromasil C18 色谱柱，流速1.0 mL/min，柱温30 ℃，进样量10 μL。在该条件下对照品溶液和样品溶液的龙血素A与龙血素B的色谱图分离效果较好，如图1所示。

2.5 方法的精密度、线性范围、检出限与定量限

取同一对照品标准系列溶液，在选定条件下进行分析，连续测定6次，以峰面积积分值测得龙血素A、B的精密度(RSD)。以峰面积积分值(Y)对对照品含量(X)进行回归处理，得到的线性回归方程；并以3倍信噪比(S/N=3)所对应的浓度为检出限(LOD)，以10倍信噪比(S/N=10)对应的浓度为定量限(LOQ)，结果见表1。从表1可看出，龙血素A在0.1030～1.5450 μg，龙血素B在0.0426～0.6390 μg范围内呈良好线性，相关系数均为1.0000。

表1 方法的精密度、线性范围、检出限及定量下限(n=6)

2.6 方法的稳定性、重现性

取同一样品(大唐汉方,批号：091001)制备供试品溶液，分别在0、18、24、30、36、42和48 h进行测定，以峰面积计算，两个成分的RSD分别为1.8%、1.0%,表明48 h内两个成分在供试品溶液中基本稳定。

精密称取龙血竭含片(大唐汉方，批号：091001)，按供试品溶液的制备方法制备6份供试品溶液，分别测定并计算含量，结果显示6份样品中龙血素A含量测定的平均值为1.8836 mg/g，RSD为1.2%，龙血素B含量测定的平均值为3.1220 mg/g，RSD为0.7%，证明方法重现性良好。

2.7 回收率实验

精密称取已知含量的样品(大唐汉方制药，批号：091001，龙血素A含量为1.8836 mg/g，龙血素B含量为3.1220 mg/g) 6份，精密加入龙血素A 0.2920 mg，龙血素B 0.5080 mg，按本方法测定，计算得龙血素A回收率在98.52%～101.64%之间，平均回收率为99.86%，RSD为1.4%；龙血素B回收率在97.81%～101.77%之间，平均回收率为99.88%，RSD为1.3%。

2.8 实际样品测定

分别取10批龙血竭含片(云南大唐汉方制药公司)，按1.2节方法处理，按照1.3节进行分析，用标准曲线法分别计算10批样品中两种成分的含量，测定结果见表2，该结果符合中国药典含量测定规定。本品按处方量计,同时考虑到不同产地来源的龙血竭原料影响因素，并根据上述10批样品的实际测定结果，样品1含龙血素A(C17H18O4)不得少于0.6 mg，龙血素B(C18H20O5)不得少于0.6 mg，总量不少于1.5 mg。

表2 样品测定结果

3 结论

本文采用自制固相小柱结合高效液相色谱技术，实现了龙血竭含片中龙血素A、B的同时测定。方法的加标回收率为97.81%～101.77%，RSD为0.3%～0.5%，检出限为0.0103～0.0043 μg，能够满足龙血竭含片中龙血素A、B的含量分析要求。方法简便快速，结果可靠，在一定程度上为龙血竭含片中龙血素A、B的质量控制提供了新方法。